通过向固体生长培养基直接添加荧光染料来检测微生物的方法与流程

文档序号:37447975发布日期:2024-03-28 18:31阅读:来源:国知局

技术特征:

1.一种用于检测或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法,所述方法包括:

2.根据权利要求1所述的方法,其中在步骤a)之前,将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上,并且其中在步骤a)中,将所述膜和微生物与所述固体生长培养基和所述至少一种荧光染料接触。

3.根据权利要求1所述的方法,其中步骤a)可以包括

4.根据权利要求3所述的方法,其中步骤a1)在步骤a2)之前进行。

5.根据权利要求4所述的方法,其中在步骤a2)之前,将所述样品的微生物浓缩在膜滤器上。

6.根据权利要求1至5中任一项所述的方法,其中所述膜滤器由混合纤维素酯(mce)、聚偏氟乙烯(pvdf)、硝酸纤维素、聚四氟乙烯、聚碳酸酯或尼龙制成。

7.根据权利要求1至6中任一项所述的方法,其中所述膜滤器由mce或pvdf制成。

8.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述膜滤器由mce制成。

9.根据权利要求1至7中任一项所述的方法,其中所述膜滤器由pvdf制成。

10.根据权利要求1至9中任一项所述的方法,其中所述固体生长培养基对所述微生物或成组微生物具有选择性。

11.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)及其组合。

12.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和4′,6-二脒基-2-苯基吲哚(dapi)及其组合。

13.根据权利要求1至10中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合.

14.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自mb660r、吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、cy5.5、优选为sulfo-cy5.5、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta650、seta 375、setau647、setau 488、alexa fluor 488、atto 647和dapi、其衍生物及其组合。

15.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自mb660r、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、cy5.5、优选为sulfo-cy5.5、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta 650、seta 375、setau647、setau 488、alexa fluor 488和atto 647、其衍生物及其组合。

16.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自mb660r-dbco、mb660r-酸、吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5酸、sulfo-cy5.5酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau488-nhs、alexa fluor488-酸、alexa fluor 488-dbco、atto 647-酸和dapi、其衍生物及其组合。

17.根据权利要求1至13中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自mb660r-dbco、mb660r-酸、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5酸、sulfo-cy5.5酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco和atto 647-酸、其衍生物及其组合。

18.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自draq5、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、bodipy 500/510、prodan、alexafluor 405、瀑布蓝、seta650、setau 647、setau 488、mb 660r、alexa fluor 488、atto 647和dapi、其衍生物及其组合,优选地选自draq5、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、setau 488-nhs、setau 647-马来酰亚胺、mb 660r-酸、mb 660r-dbco、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、atto 647-酸和dapi及其组合。

19.根据权利要求1至12中任一项所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自draq5、alexa fluor 350、cy5、优选为sulfo-cy5、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、seta 650、setau 647、mb 660r、alexa fluor 488、atto 647和dapi、其衍生物及其组合,优选地选自draq5、alexa fluor 350-nhs酯、sulfo-cy5酸、bodipy 500/510、prodan、alexafluor 405-dbco、seta 650-dbco、setau 647-马来酰亚胺、mb 660r-酸、mb 660r-dbco、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、atto 647-酸和dapi及其组合。

20.根据权利要求1至19中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物

21.根据权利要求1至20中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物

22.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于嗜热嗜酸细菌的微生物,优选地选自酸土脂环酸芽孢杆菌、酸热脂环酸芽孢杆菌、嗜酸脂环酸芽孢杆菌、环庚烷脂环酸芽孢杆菌、alicyclobacillus hesperidum、alicyclobacillus herbarius和alicyclobacillus contaminans及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料,优选地选自mb660r、alexa fluor 488和atto647及其衍生物和组合,更优选地选自mb660r-酸、mb660r-dbco、alexa fluor 488-酸、alexafluor488-dbco和atto647-酸及其组合。

23.根据权利要求22所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料,优选地选自mb660r和衍生物,更优选地选自mb660r-酸和mb660r-dbco,甚至更优选为mb660r-dbco。

24.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于醋酸菌(aab)的微生物,优选地选自属于醋杆菌属、葡糖杆菌属、葡糖醋杆菌属和亚细亚菌属的细菌及其组合,更优选地选自醋酸醋杆菌(acetobacter aceti)、液化葡糖醋杆菌(gluconoacetobacter liquefaciens)、氧化葡糖杆菌(gluconobacteroxydans)和暹罗亚细亚菌(asaia siamensis)及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和dapi及其组合,优选地选自alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。

25.根据权利要求24所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料,优选地选自alexa fluor 488、mb660r和atto647及其衍生物和组合,更优选地选自alexafluor 488-酸、alexa fluor488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。

26.根据权利要求24所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自mb660r和atto647及其衍生物和组合,优选地选自mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合,更优选地选自mb660r-酸和atto647-酸及其组合。

27.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于乳酸菌(lab)的微生物,优选地选自属于乳杆菌属和魏斯氏菌属的细菌及其组合,更优选地选自干酪乳杆菌(lactobacillus casei)、植物乳杆菌(lactobacillusplantarum)和融合魏斯氏菌(weissellas confusa)及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和dapi及其组合,优选地选自alexa fluor488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。

28.根据权利要求27所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自alexa fluor 488、mb660r和dapi及其衍生物和组合,特别是选自alexa fluor 488-酸、mb660r-酸和dapi及其组合,优选地选自基于呫吨的染料,更优选地选自alexa fluor 488-酸和mb660r-酸及其组合,甚至更优选为mb660r-酸。

29.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于厌氧细菌的微生物,优选地选自梭状芽孢杆菌属和丙酸杆菌属细菌及其组合,更优选地选自生芽孢梭状芽孢杆菌(clostridium sporogenes)和痤疮丙酸杆菌(cutibacterium acnes)及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和dapi及其组合,优选地选自mb660r、cy5、优选为sulfo-cy5、和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自mb660r-dbco、sulfo-cy5酸和dapi及其组合。

30.根据权利要求29所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料,优选地选自mb660r和cy5、优选为sulfo-cy5、及其衍生物和组合,更优选地选自mb660r-dbco和sulfo-cy5酸及其组合。

31.根据权利要求29所述的方法,其中所述至少一种荧光染料包括mb660r-dbco和sulfo-cy5酸。

32.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于好氧中温细菌(amb)的微生物,优选地选自属于甲基杆菌属、假单胞菌属、芽孢杆菌属、埃希氏杆菌属、葡萄球菌属、不动杆菌属、克罗诺杆菌属、克雷伯氏菌属、沙门氏菌属、肠球菌属、志贺氏菌属、考克氏菌属和伯克霍尔德氏菌属的细菌及其组合,更优选地选自扭脱甲基杆菌(methylobacterium extorquens)、铜绿假单胞菌(pseudomonasaeruginosa)、枯草芽孢杆菌(bacillus subtilis)、大肠埃希氏杆菌(escherichia coli)、金黄色葡萄球菌(staphylococcus aureus)、鲍曼不动杆菌(acinetobacter baumannii)、阪崎克罗诺杆菌(cronobacter sakazakii)、肺炎克雷伯氏菌(klebsiella pneumoniae)、鼠伤寒沙门氏菌(salmonella typhimurium)、粪肠球菌(enterococcus faecalis)、宋内志贺氏菌(shigella sonnei)、嗜根考克氏菌(kocuria rhizophila)和洋葱伯克霍尔德氏菌(burkholderia cepacia)及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、吖啶染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合,优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、bodipy染料、优选为bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料、优选为seta650或seta 375、setau染料、优选为setau 647或setau 488、alexa fluor 488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。

33.根据权利要求32所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合,优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、bodipy染料、优选为bodipy500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料、优选为seta 650或seta 375、setau染料、优选为setau 647或setau 488、alexa fluor 488、mb660r和atto647及其衍生物和组合,更优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。

34.根据权利要求32所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料,优选地选自mb660r及其衍生物和组合,任选地与选自基于花青的染料的荧光染料、优选为cy5、特别是sulfo-cy5组合,更优选为mb660r-dbco,任选地与sulfo-cy5-酸组合。

35.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物,优选地选自属于埃希氏杆菌属、变形杆菌属和假单胞菌属的细菌及其组合,更优选地选自大肠埃希氏杆菌、奇异变形杆菌(proteusmirabilis)和铜绿假单胞菌及其组合,并且所述至少一种荧光染料可以选自基于呫吨的染料、优选为罗丹明染料、基于花青的染料和dapi及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5、mb660r和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合。

36.根据权利要求35所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5、mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

37.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阴性细菌的微生物,优选地选自属于埃希氏杆菌属和假单胞菌属的细菌及其组合,更优选地选自大肠埃希氏杆菌和铜绿假单胞菌及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选为罗丹明染料、基于芘的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料和dapi及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5、alexa fluor 350、alexa fluor 405、mb660r和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸、alexafluor 350-nhs酯、alexa fluor 405-dbco、mb660r-dbco和dapi及其组合。

38.根据权利要求37所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选为罗丹明染料、基于芘的染料、基于香豆素的染料和基于花青的染料及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5、alexa fluor 350、alexa fluor 405和mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸、alexa fluor 350-nhs酯、alexa fluor 405-dbco和mb660r-dbco及其组合。

39.根据权利要求37所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于芘的染料、基于香豆素的染料及其组合,优选地选自alexa fluor350和alexa fluor 405及其衍生物和组合,更优选地选自alexa fluor350-nhs酯、alexa fluor 405-dbco及其组合。

40.根据权利要求37所述的方法,其中所述至少一种荧光染料是alexa fluor 350-nhs酯与alexa fluor 405-dbco的组合。

41.根据权利要求37所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5、mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

42.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于革兰氏阳性细菌的微生物,优选地选自属于葡萄球菌属和肠球菌属的细菌及其组合,更优选地选自金黄色葡萄球菌和粪肠球菌及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于花青的染料和dapi及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5、mb660r、dapi及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合。

43.根据权利要求42所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料和基于花青的染料及其组合,优选地选自cy5、优选为sulfo-cy5和mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

44.根据权利要求1至15中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于异养细菌的微生物,优选地选自属于不动杆菌属、气单胞菌属、短波单胞菌属、伯克霍尔德氏菌属、柠檬酸杆菌属、爱德华氏菌属、肠杆菌属、埃希氏杆菌属、苍白杆菌属、克雷伯氏菌属、甲基杆菌属、莫拉氏菌属、泛菌属、变形杆菌属、假单胞菌属、罗尔斯通菌属、沙门氏菌属、沙雷氏菌属、志贺氏菌属、鞘氨醇单胞菌属、寡养单胞菌属、耶尔森氏菌属、芽孢杆菌属、肠球菌属、微球菌属、葡萄球菌属的细菌及其组合,更优选地选自鲍曼不动杆菌、嗜水气单胞菌(aeromonas hydrophila)、缺陷短波单胞菌(brevundimonas diminuta)、洋葱伯克霍尔德氏菌、弗氏柠檬酸杆菌(citrobacter freundii)、迟缓爱德华氏菌(edwardsiella tarda)、产气肠杆菌(enterobacter aerogenes)、大肠埃希氏杆菌、人苍白杆菌(ochrobactrum anthropic)、肺炎克雷伯氏菌、扭脱甲基杆菌、奥斯陆莫拉氏菌(moraxella osloensis)、成团泛菌(pantoea agglomerans)、奇异变形杆菌、铜绿假单胞菌、荧光假单胞菌(pseudomonas fluorescens)、皮氏罗尔斯通菌(ralstonia pickettii)、鼠伤寒沙门氏菌、黏质沙雷氏菌(serratia marcescens)、宋内志贺氏菌、少动鞘氨醇单胞菌(sphingomonas paucimobilis)、嗜麦芽寡养单胞菌(stenotrophomonas maltophilia)、小肠结肠炎耶尔森氏菌(yersinia enterocolitica)、枯草芽孢杆菌、粪肠球菌、滕黄微球菌(micrococcus luteus)(嗜根考克氏菌)、金黄色葡萄球菌及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合,优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、cy5.5、优选为sulfo-cy5.5、bodipy染料、优选为bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料、优选为seta 650或seta 375、setau染料、优选为setau 647或setau 488、alexa fluor488、mb660r、atto647和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自吖啶橙、draq5、cytrak橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、sulfo-cy5.5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco、atto647-酸和dapi及其组合。

45.根据权利要求44所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、基于蒽的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合,优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、cy5.5、优选为sulfo-cy5.5、bodipy染料、优选为bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、seta染料、优选为seta 650或seta 375、setau染料、优选为setau 647或setau 488、alexa fluor488、mb660r和atto647及其衍生物和组合,更优选地选自draq5、cytrak橙、alexa fluor350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、sulfo-cy5.5-酸、bodipy 500/510、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、setau 488-nhs、alexa fluor 488-酸、alexa fluor 488-dbco、mb660r-酸、mb660r-dbco和atto647-酸及其组合。

46.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含属于酵母和霉菌的微生物,优选地选自属于假丝酵母属、接合酵母属、曲霉属、酵母属、地霉属和青霉属的真菌及其组合,更优选地选自白假丝酵母(candida albicans)、拜氏接合酵母(zygosaccharomyces bailii)、巴西曲霉(aspergillus brasiliensis)、酿酒酵母(saccharomyces cerevisiae)、白地霉(geotrichumcandidum)、宛氏青霉(penicillium variotii)、产黄青霉(penicilliumchrysogenum)及其组合,并且所述至少一种荧光染料选自吖啶染料、基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料、基于方酸轮烷的染料和dapi及其组合,优选地选自吖啶橙、alexa fluor350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、prodan、alexa fluor405、瀑布蓝、bodipy 500/510、seta染料、优选为seta 650、setau染料、优选为setau 647或setau 488、alexa fluor 488、mb660r和dapi及其衍生物和组合,更优选地选自吖啶橙、alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、prodan、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、bodipy 500/510、seta 650-dbco、setau 647-马来酰亚胺、setau488-nhs、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸、mb660r-dbco和dapi及其组合。

47.根据权利要求46所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于二吡咯甲川的染料、基于萘的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合,优选地选自alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、prodan、alexa fluor 405、瀑布蓝、bodipy 500/510、seta染料、优选为seta 650、setau染料、优选为setau 647或setau 488、alexa fluor 488和mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝-nhs酯、sulfo-cy5-酸、prodan、alexafluor 405-dbco、瀑布蓝、bodipy 500/510、seta 650-dbco、setau 647-马来酰亚胺、setau488-nhs、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸和mb660r-dbco及其组合。

48.根据权利要求46所述的方法,其中所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料,优选地选自mb660r及其衍生物和组合,优选为mb660r-dbco。

49.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(tab)、醋酸菌(aab)、乳酸菌(lab)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌、异养细菌及其组合的一种或几种细菌,以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合,优选地选自alexa fluor 350、太平洋蓝、cy5、优选为sulfo-cy5、alexa fluor 405、瀑布蓝tm、seta染料、优选为seta 650或seta 375、setau染料、优选为setau 647和setau 488、alexafluor 488和mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自alexa fluor 350-nhs酯、太平洋蓝tm-nhs酯、sulfo-cy5-酸、alexa fluor 405-dbco、瀑布蓝、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 488-nhs、setau 647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸和mb660r-dbco及其组合,甚至更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

50.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物包含优选地选自嗜热嗜酸细菌(tab)、醋酸菌(aab)、乳酸菌(lab)、厌氧细菌、好氧中温细菌、革兰氏阴性细菌和革兰氏阳性细菌及其组合的一种或几种细菌,以及优选地选自酵母和霉菌的一种或几种微观真菌,并且所述至少一种荧光染料选自基于呫吨的染料、优选地选自罗丹明染料、荧光素染料和基于carbopyronine的染料、基于香豆素的染料、基于花青的染料、基于芘的染料、基于方酸的染料和基于方酸轮烷的染料及其组合,优选地选自alexa fluor 350、cy5tm、优选为sulfo-cy5、alexa fluor 405、seta染料、优选为seta 650或seta 375、setau染料、优选为setau 647、alexa fluor 488和mb660r及其衍生物和组合,更优选地选自alexa fluor 350-nhs酯、sulfo-cy5-酸、alexa fluor 405-dbco、seta 650-dbco、seta 375-nhs、setau 647-马来酰亚胺、alexa fluor 488-酸、mb660r-酸和mb660r-dbco及其组合,甚至更优选地选自sulfo-cy5-酸和mb660r-dbco及其组合。

51.根据权利要求1至11中任一项所述的方法,其中所述感兴趣的微生物或成组微生物属于或包含选自巴西曲霉、白假丝酵母和大肠埃希氏杆菌及其组合的微生物,并且所述至少一种荧光染料选自bodipy 500/510;alexa fluor 350或其衍生物,优选为alexa fluor350-nhs酯;太平洋蓝或其衍生物,优选为太平洋蓝-nhs酯;prodan;alexa fluor 405或其衍生物,优选为alexa fluor 405-dbco;瀑布蓝;seta 650或其衍生物,优选为seta 650-dbco;setau 488或其衍生物,优选为setau 488-nhs;setau 647或其衍生物,优选为setau647-马来酰亚胺,及其任何组合。

52.根据权利要求2至51中任一项所述的方法,其中在步骤b)之后并且在步骤c)之前,将所述膜滤器从所述固体生长培养基上取下,并在步骤c)中检测和/或计数其上的微菌落。

53.根据权利要求1至52中任一项所述的方法,其中在步骤c)中,使用荧光显微镜或固相细胞仪检测和/或计数发射荧光信号的微菌落。

54.如权利要求1至53中任一项所定义的方法用于确定样品是否含有至少一种感兴趣的微生物,用于确定样品是否无菌,或用于确定样品的生物负载的用途。

55.一种试剂盒用于根据权利要求1至54中任一项的方法检测和/或计数感兴趣的微生物或成组微生物的用途,所述试剂盒包含:


技术总结
本发明涉及一种用于检测和/或计数感兴趣的微生物或成组微生物的方法,所述方法包括:a)将怀疑含有所述微生物或成组微生物的样品与含有支持所述微生物或成组微生物生长的营养物的固体生长培养基并与至少一种荧光染料在容器中接触;b)将所述容器在足以形成所述微生物或成组微生物的微菌落的条件下温育足够的时间;和c)检测和/或计数发射所述至少一种荧光染料的荧光信号的微菌落,从而检测、鉴定和/或计数所述样品中包含的所述微生物或成组微生物。

技术研发人员:亚历山大·穆勒,奥德丽·杜蒙特,萨姆·杜坎
受保护的技术使用者:迪亚米德克斯公司
技术研发日:
技术公布日:2024/3/27
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