一种环境中大环内酯类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒及检测方法

本发明属于生物，具体涉及一种环境中大环内酯类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒及检测方法。

背景技术：

1、抗生素自被发现以来在临床医学、畜牧养殖以及农业病虫害防治等领域的广泛应用已导致耐药病原菌和抗性基因的传播，其危害受到世界范围的重视。2014年世界卫生组织(worldhealth organization，who)的报告提出抗生素抗性为21世纪面临的最严峻的人类健康挑战，需要加强全球抗药性的监管。早已有研究提出将抗性基因作为一种新的环境污染物。

2、大环内酷类抗生素是一类弱碱性抗生素,作用于细菌细胞核糖体505亚单位,阻碍细菌蛋白质的合成,属于生长期抑制剂。抗菌谱包括葡萄球菌,化脓性及草绿色链球菌,肺炎球菌、淋球菌、产气杆菌、布氏杆菌、钩端螺旋体、肺炎支原体、立克次体和衣原体等，临床土主要用于对青霉素过敏的g+菌感染者及无细菌型的立克次体、衣原体等。肌肉注射后大部分以原药经肾排泄，同时粪肥和抗生素又被用在农业上，并可能转移至土壤及周围人体中，最终进入食物链，对动物和人体健康以及生态系统构成潜在威胁。

3、细菌对大环内酯类抗生素逐渐产生了抗性，耐药菌残留在动物及农作物中，继而危害人类健康。另一方面，抗生素在禽畜养殖中的滥用以及环境中残留诱导微生物产生耐药基因，因此环境中大环内酯类抗生素及抗性基因的调查和控制至关重要。目前检测抗性基因最常用的方法是qpcr和宏基因组的方法。其中宏基因组的方法，能检测样本中目前已注释的所有arg的信息，但是价格昂贵，不适合大范围多样本的检测；传统的qpcr虽然便宜，能进行绝对定量，但是通量小，一次最多只能进行384个qpcr反应；目前用qpcr方法做args检测时，做绝对定量的方法是仅绘制16s rrna一条标准曲线，然后用相对定量的比值乘以对应的16s rrna绝对拷贝数，具体公式如下：

4、相对拷贝数计算公式：

5、gene copy number＝10(31-ct)/(10/3)

6、绝对拷贝数计算公式：

7、目的基因绝对拷贝数＝16s rrna绝对拷贝数*(目的基因的相对拷贝数

8、/16srrna的相对拷贝数)

9、但是以上公式计算出来的绝对拷贝数其实并不准确。最为准确的方法是每种arg都构建一个标准品，然后各绘制一个标准曲线。分别计算各自的绝对拷贝数。但是由此会增加另外一个难点，就是随着args的引物数增加时，计算绝对拷贝数的工作量会越来越大。

技术实现思路

1、针对现有技术中qpcr方法通量小、计算绝对拷贝数工作量大等问题，本发明提供了一种环境中大环内酯类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒及检测方法。

2、为了实现上述目的，本发明提供了一种环境中大环内酯类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒，包括特异性引物、qpcr反应试剂、smart chip芯片以及wafergen耗材，所述特异性引物由45对大环内酯类抗生素抗性基因和内参16s rrna基因的特异性引物组成，共46对特异性引物，所述wafergen耗材包括384深孔板、qpcr膜、芯片暂封膜、芯片滤膜和芯片qpcr膜。

3、优选地，所述特异性引物的序列如下：

4、

5、

6、优选地，所述试剂盒还包括阳性对照品和阴性对照品，所述阳性对照品为45个大环内酯类抗生素抗性基因标准品以及内参16s rrna基因标准品，所述阴性对照品为depc水，所述16s rrna基因标准品序列如下：

7、gcccgtgacctcgtcgtattgactgcatcgcgtgtcgcccttgatcctaaacataaccactaactgcaatatcttattatcatcatgttccacagctcctcaggctttattcatgtccattcttcatcaaattcgtcatttttcaccaaaatgcattgtgataaacgattatcacttaagataatcgattgtcttagtgaaatttaaccagaaacatcatgcaggatgtgataattgaatatcaacccagataatcaattattcctaaaaccattttcaaaacctacatgcaactaatcaaagggcgacacgcgattgcagcgagcctcagacactggccgtcgttttacacaat

8、caagtcgtgactgggaaaaccctggcgctcactggctcaccttcacgggtgggccttt

9、cttcggtagaaaatcaaaggatcttcttgagatcctttttttctgcgcgtaatctgctg

10、cttgcaaacaaaaaaaccaccgctaccagcggtggtttgtttgccggatcaagagcta

11、ccaactctttttccgaggtaactggcttcagcagagcgcagataccaaatactgttctt

12、ctagtgtagccgtagttaggccaccacttcaagaactctgtagcaccgcctacatacct

13、cgctctgctaatcctgttaccagtggctgctgccagtggcgataagtcgtgtcttaccg

14、ggttggactcaagacgatagttaccggataaggcgcagcggtcgggctgaacggggg

15、gttcgtgcacacagcccagcttggagcgaacgacctacaccgaactgagatacctaca

16、gcgtgagctatgagaaagcgccacgcttcccgaagggagaaaggcggacaggtatcc

17、ggtaagcggcagggtcggaacaggagagcgcacgagggagcttccagggggaaa。

18、优选地，所述阳性对照品的构建方法为：

19、第一步：用46对所述特异性引物大量筛选环境样本，所述筛选是通过qpcr的方法扩增环境样本，所述环境样本类型为核酸样本；

20、第二步：观察qpcr的扩增曲线跟溶解曲线，溶解曲线单峰，扩增曲线的ct值小于25，判定此反应的样本为对应特异性引物的候选样本；

21、第三步：用特异性引物pcr扩增对应的候选样本；

22、第四步：pcr产物进行琼脂糖电泳、切胶回收、一代测序，测序结果在ncbi数据库中进行比对，确定为特异性引物对应的基因，则此候选样本为阳性样本；

23、第五步：用特异性引物pcr扩增对应的阳性样本；

24、第六步：pcr产物进行琼脂糖电泳、切胶回收、并将回收的pcr片段与质粒进行构建，构建的质粒即为阳性对照。

25、优选的，所述阳性对照用于绘制标准曲线，计算样本的绝对拷贝数。

26、优选的，所述smartchip芯片为一张72*72孔位的芯片，一次最多可进行5184个qpcr反应。

27、优选的，所述smartchip芯片内预喷有46对所述特异性引物。

28、一种使用上述环境中大环内酯类抗生素抗性基因的高通量定量检测试剂盒的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

29、第一步：标准曲线绘制，用双蒸水将46对所述特异性引物构建的阳性质粒进行10倍梯度稀释，做5个梯度，以10倍系列稀释的阳性质粒溶液作为模板，应用46对所述特异性引物分别进行qpcr扩增，然后绘制标准曲线；

30、第二步：环境样本dna提取，浓度测定，质检，样本均一化；

31、第三步：上机检测，反应体系与反应程序第一步绘制标准曲线的反应体系及反应程序相同；

32、第四步：下机数据处理，删除一些没有扩增的数据，将保留的数据通过自动化脚本对应各自的标准曲线计算绝对拷贝数；

33、优选的，所述的样本均一化，是将样本浓度统一稀释到5ng/μl-10ng/μl。与现有技术相比，本发明有如下优点：

34、1、设计的45对args引物基本上覆盖了目前已注释的所有大环内酯类抗生素抗性基因，16s rrna的加入不仅为后续做相对丰度提供数据支持，同时也可作为内参基因，佐证下机数据的可靠性。

35、2、采用wafergen平台进行args检测，很好的解决了目前qpcr方法通量低的缺点。

36、3、自行编写的自动化脚本，实现快速绝对拷贝数的计算。

37、4、将以上46对引物预喷在芯片上，然后组装成试剂盒，方便后续环境测检点的快速检测。

38、5、通过检测到的args，进行进化树分析，将序列相似的抗生素分为一类，

39、分析每一大类抗生素的丰度情况。

40、本发明的其他特征和优点将在随后的具体实施方式中予以详细说明。