一种重组大肠杆菌工程菌及其全细胞催化制备茶黄素的方法与流程

本发明属于生物，涉及到一种重组大肠杆菌工程菌e.coli bl21/petduet-bmtyrc-24-bmtyrc-25构建、大肠杆菌全细胞催化剂的制备、以及利用其催化生产茶黄素的方法。

背景技术：

1、红茶是世界上消费最多的茶类，占茶叶消费总量的70-80％，茶黄素是红茶品质的关键有效成分，其形成过程是茶多酚类物质在细胞内多酚氧化酶、过氧化物酶的催化作用下，经氧化自聚合后形成的一类物质，通常会逐步转变为茶黄素、茶红素、茶褐素等物质。研究表明茶黄素具有一系列健康功效，如抗氧化、抗炎、降血糖、降脂减肥、抗病毒等功能。因此开发茶黄素系列产品具有广阔的市场前景。

2、目前茶黄素的获得主要通过三种途径获得，(1)从红茶中直接提取；(2)化学法氧化合成；(3)生物催化法合成。由于茶黄素在红茶中含量较少，只占红茶干重的2-3％，从红茶中提取需要用到有机溶剂，容易造成环境污染且纯化工艺繁琐，不符合低碳绿色发展的理念。同样的，采用化学氧化法制备也存在相同的弊端，化学氧化过程需要用到化学氧化试剂如铁氰化钾、三氧化铁、氧化酶及酸碱等，环境污染严重，并且化学氧化法由于对底物缺乏专一性，容易形成副产物，对后期产品质量的控制、分离纯化有一定的限制。生物催化法合成可以摒弃上述弊端，生物酶促氧化法以茶多酚为底物，专一性强，特异性好，反应条件温和，不需要有机溶剂，可控性强，符合绿色低碳的发展方向和理念，是未来最有前景的一种生产方法。目前报道较多的为从植物细胞破碎液中提取多酚氧化酶催化底物儿茶素进行茶黄素的合成，但是该方法受限于原材料的限制，容易收到季节影响，从植物中提取多酚氧化酶得率低，无法规模化控制和应用。因此采用现代基因工程、蛋白质工程技术手段制备外源多酚氧化酶，实现多批次高效率重复使用，用于茶黄素的合成，既符合绿色低碳发展理念，生产高效且成本低，具有广阔的市场前景。

3、目前已有相关文献或专利进行了体外酶法催化合成茶黄素的报道，如在文献中(王斌,江和源等.固定化多酚氧化酶填充床反应器连续制备茶黄素[j].食品与发酵工业,2011,37(05):40-44)对多酚氧化酶进行了固定化并实现了茶黄素的连续制备，并对连续制备茶黄素的反应条件进行了摸索，表明在反应ph5.6,温度为28℃时候，儿茶素的转化率能达到20.99％，为茶黄素的工业化制备提供了一种新的思路；在专利cn201580034729.3中，发明人茶黄素催化剂用金属纳米颗粒进行锚定，实现了茶黄素的制备；在专利cn202110868216.5中，发明人对茶黄素合成用催化剂进行了筛选改造，获得了能高效催化合成茶黄素的催化剂。要想实现茶黄素体外酶促定向催化合成，酶的效率和成本是关键，本发明从这两个关键问题出发，一方面实现了多酚氧化酶的共表达构建解决酶对不同多酚底物催化效率低的问题；另一方面构建了全细胞催化剂用于茶黄素的制备，解决了酶多批次稳定使用问题，降低了成本。

4、以茶黄素为关键词，进行发明名称查找国家知识产权局专利检索数据库，共出现185条有效专利检索结果，其中大多以茶黄素的提取方法、相关应用、相关反应装置等专利为主，未见全细胞催化合成茶黄素的报道；同时经过相关文献检索，目前尚未见有全细胞催化剂制备茶黄素方法的报道。

5、公开于该背景技术部分的信息仅仅旨在增加对本发明的总体背景的理解，而不应当被视为承认或以任何形式暗示该信息构成已为本领域一般技术人员所公知的现有技术。

技术实现思路

1、本发明的首要目的是提供一种用于茶黄素催化合成的基因工程菌株及其利用该工程菌株制备的全细胞催化剂催化合成茶黄素的方法。该发明技术与现有的报道的技术路线相比，其有益效果在于：两种多酚氧化酶共表达，其针对不同底物egcg和ecg的催化效率更高，茶黄素tfdg的产率更高；其次全细胞催化剂相比传统的固定化酶的制备方法，不需要添加载体、节省了原材料成本，且菌体全细胞催化剂制备操作更简单、时间短、成本低、且可实现多批次回收使用。

2、为实现此目的，本发明采用的技术方案如下：

3、一种重组大肠杆菌工程菌，含有氨基酸序列如seq id no.1所示的酶突变体基因bmtyrc24和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的酶突变体基因bmtyrc25的表达载体。

4、本发明酶突变体bmtyrc24为多酚氧化酶，其对底物egcg催化活性较高；酶突变体bmtyrc25也为多酚氧化酶，其对底物ecg催化活性较高。

5、本发明提供了所述的重组大肠杆菌工程菌在全细胞催化制备茶黄素中的应用。具体包括如下步骤：

6、(1)全细胞催化剂的制备：将构建的重组大肠杆菌工程菌活化后进行发酵培养，诱导目的酶进行表达后，收集菌体；将菌体采用透性化试剂进行重悬处理，然后离心，去掉上清，用去离子水重悬后离心备用；

7、(2)茶黄素tfdg的合成：配制底物溶液，加入适量菌体进行重悬，置于适当条件下催化合成茶黄素tfdg，离心后上清即得含有产物的溶液。

8、步骤(1)采用的透性化试剂包括：十六烷基三甲基溴化铵ctab、聚乙二醇辛基醚triton x-100、甲苯、乙醇溶液中的至少一种。优选0.5-1％的ctab、0.5-2％的聚乙二醇辛基醚triton x-100、0.5-1％的甲苯、5％的乙醇溶液。

9、步骤(1)所用透性化试剂的反应浓度为0.5％-4％，处理时间为10-120min，优选30-40min；ph为3.0-5.0，温度为28-32℃。

10、步骤(2)催化合成茶黄素tfdg反应参数为：全细胞催化剂50-100g/l，底物溶液ph为4.0-6.0，反应温度25-35℃，cu2+浓度为0.1-0.2mm，反应时间30-60min，底物egcg浓度为1-8mg/ml，底物ecg浓度为1-4mg/ml，搅拌转速180-200r/min。

11、步骤(2)底物溶液包括柠檬酸-磷酸盐缓冲液。

12、步骤(2)反应完成后离心得到的菌体沉淀能重复用于下一批次催化反应。

13、本发明还提供了氨基酸序列如seq id no.1所示的酶突变体bmtyrc24和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的酶突变体bmtyrc25。

14、本发明还提供了含有氨基酸序列如seq id no.1所示的酶突变体基因bmtyrc24和/或氨基酸序列如seq id no.2所示的酶突变体基因bmtyrc25的表达载体。

15、本发明以tfdg氧化产物为例，制备方法步骤如下：

16、(1)基因工程菌株的构建：多酚氧化酶基因bmtyrc24构建至载体petduet-1中的多克隆位点mcs1中，基因5’端带有ncoi酶切位点，基因3’端带有hindiii酶切位点；多酚氧化酶基因bmtyrc25构建至petduet-1的多克隆位点mcs2中，基因5’端带有ndei酶切位点，基因3’端带有xhoi酶切位点。

17、(2)全细胞催化剂的制备：将构建的工程菌株进行活化，活化后的菌株进行发酵培养，诱导目的酶进行表达后，离心收集菌体。将菌体用含有0.5-4％浓度化学试剂的溶液进行重悬处理，30℃处理60min；然后离心，去掉上清，用去离子水重悬后离心备用；

18、(3)茶黄素tfdg的合成。用柠檬酸-磷酸盐缓冲液配制底物溶液，加入适量菌体进行重悬，置于适当条件下催化合成茶黄素tfdg，离心后上清即得含有产物的溶液，菌体沉淀即可重复用于下一批次催化反应。

19、本发明方法与现有的常规方法相比，有益效果在于：

20、(1)两种多酚氧化酶共表达，其针对不同底物egcg和ecg的催化效率更高，茶黄素tfdg的产率更高；

21、(2)全细胞催化剂制备相比传统的固定化酶的制备，不需要添加载体、省略了原材料的成本，操作更简单、成本更低、生成的产物不会结合在菌体(载体)上导致酶活性丢失，可实现多批次回收使用，明显降低了生产应用成本，具有工业应用属性。