共表达FOSB的嵌合抗原受体及其应用的制作方法

本发明涉及医药生物领域，具体是指一种以共表达fosb的嵌合抗原受体(car)及其在肿瘤治疗中的应用。

背景技术：

1、car-t介绍

2、肿瘤免疫治疗是指应用免疫学的原理和方法，提高肿瘤的免疫原性，利用自身的免疫系统攻击肿瘤细胞，从而抑制或杀伤肿瘤细胞。按其治疗策略分为两大类：免疫检查点抑制剂(如ctla-4、pd-1、pd-l1等)和细胞免疫治疗(如car-t等)。其中car-t细胞全称为嵌合抗原受体t细胞(chimeric antigen receptort-cell)，原理为通过基因工程的方法，将能识别某种肿瘤抗原的抗体单链可变区(scfv)与cd3-ζ链的胞内区在体外偶联为一个嵌合蛋白，通过基因转导的方法转染体外培养的患者t细胞，使其表达嵌合抗体受体(car)。患者的t细胞被“重编程”后，生成大量具有杀伤性的car-t细胞，能够特异性的靶向肿瘤细胞。car-t与传统的免疫疗法相比，具有治疗更精确、靶向更精准、杀瘤更广泛、效果更持久等显著优势。

3、尽管目前在car-t治疗肿瘤领域捷报不断，但是car-t细胞治疗肿瘤过程中仍然面临着诸多问题。其中，car-t细胞需要浸润到肿瘤中，发挥功能是导致car-t疗法仅在小部分病人中有效果的主要原因，并直接导致了car-t疗法在治疗过程中的局限性。因此，促进car-t细胞浸润和激活、发挥功能成为car-t治疗有效性至关重要的一步。

4、延胡索酸水解酶fh(fumarate hydratase)编码三羧酸循环中的线粒体蛋白，其基因突变或低表达在多种肿瘤中高发，尤其对肾癌的发展起重要作用。临床上发现，在肾癌病人中，fh低表达伴随更差的生存率。同时，fh低表达的肾癌病人伴随低的功能性cd8+t细胞浸润。在小鼠肿瘤细胞中敲低fh或抑制fh酶活，均可有效地抑制功能性cd8+t细胞的浸润，促进肿瘤生长。进一步的，在抗cd19 car-t细胞中抑制fh酶活，亦显著阻断car-t细胞对cd19肿瘤的杀伤和抑制。然而，过表达fh是否促进car-t细胞治疗肿瘤的效果，尚未发现。

技术实现思路

1、针对现有技术的不足，本发明提供一种共表达fosb蛋白的嵌合抗原受体(car)，携带靶向cd19的scfv序列的car-t细胞增加了car t细胞的功能，减少了终端分化和提高了抗肿瘤能力。car t细胞过度表达fosb使car t具有更高的肿瘤杀伤能力，解决了这类新兴治疗药物进展的主要障碍。

2、本发明一方面涉及一种嵌合型抗原受体，其特征在于，从n端到c端顺次拼接信号肽、靶向cd19的单链抗体scfv、strepii、cd8 hinge、cd28跨膜区、cd28胞内结构域、胞内共刺激域4-1bb、和cd3ζ链，在cd3ζ链的c端进一步拼接有p2a核苷酸序列和能够表达fosb蛋白的核苷酸序列。

3、优选地，所述单链抗体scfv的氨基酸序列如seq id no.1所示，所述单链抗体scfv的核苷酸序列如seq id no.2所示，所述单链抗体scfv特异性识别肿瘤细胞表面的cd19抗原蛋白。

4、本发明另一方面提供的嵌合型抗原受体car，从n端到c端顺次拼接信号肽、靶向cd19的单链抗体scfv、strepii、cd8hinge、cd28跨膜区、cd28胞内结构域、胞内共刺激域4-1bb和cd3ζ链；在cd3ζ链的c端进一步拼接有p2a肽和fosb。

5、优选地，所述能够识别肿瘤细胞表面cd19抗原的单链抗体scfv的氨基酸序列如seq id no.1，所示scfv的核苷酸序列如seq id no.2所示。

6、优选地，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.3，核苷酸序列如seq id no.4所示；cd8hinge的氨基酸序列如seq id no.5，核苷酸序列如seq id no.6所示；cd28跨膜区、cd28胞内结构域的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq id no.9，核苷酸序列分别如seqid no.8、seq id no.10所示；胞内共刺激域4-1bb的氨基酸序列如seq id no.11，核苷酸序列如seq id no.12所示；cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.13所示，核苷酸序列如seq idno.14所示；优选地，所述p2a蛋白的氨基酸序列如seq id no.15所示，所述p2a蛋白的核苷酸序列如seq id no.16所示；优选地，所述fosb蛋白的氨基酸序列如seq id no.17所示，所述fosb蛋白的核苷酸序列如seq id no.18所示。

7、本发明另一方面还涉及一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，其特征在于，以ptk881-ef1α载体为骨架，插入上述的嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒、逆转录病毒或转座子载体；优选地，以ptk881-ef1α载体为骨架，插入如上述嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒载体；优选地，crispr、rna干扰技术联合fosb和嵌合型抗原受体原件的表达。

8、本发明另一方面还涉及一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于，由上述嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列或上述重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到，所述免疫细胞选自脐带血、外周血、肿瘤组织或ipsc来源的t细胞、nk细胞、nkt细胞、αβt细胞、γδt细胞、cd4+t细胞，cd8+t细胞，优选为外周血来源的t细胞；所述嵌合型抗原受体的单链抗体scfv结合cd19受体。

9、本发明另一方面涉及上述免疫细胞的用途，所述免疫细胞用于制备治疗细胞膜外表达cd19抗原的肿瘤的药物中的应用。

10、在本发明的一个优选实施方式中，所述肿瘤包括但不限于急性淋巴细胞白血病(r/rall)，弥漫性大b细胞淋巴瘤(r/rdlbcl)。本发明另一方面涉及上述免疫细胞的用途，所述免疫细胞用于过表达fosb和分泌颗粒酶b。

11、在一些实施例中，表达嵌合型抗原受体的免疫细胞进行体外功能检测时，所选择为细胞膜外表达cd19抗原的细胞系。

12、本发明的有益效果在于：

13、1、本发明提供的cd19为靶点的嵌合抗原受体包括特定的单链抗体scfv，其用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞能用于表面cd19阳性的肿瘤的治疗。

14、2、本发明提供的嵌合抗原受体过表达fosb，使cart细胞强激活，分泌更多的颗粒酶b，提高其杀瘤效果。

技术特征：

1.一种嵌合型抗原受体，从n端到c端顺次拼接信号肽、靶向cd19的单链抗体scfv、strepii、cd8hinge、cd28跨膜区、cd28胞内结构域、胞内共刺激域4-1bb和cd3ζ链；在cd3ζ链的c端进一步拼接有p2a核苷酸序列和能够表达fosb蛋白的核苷酸序列。

2.根据权利要求1所述的抗原受体，所述单链抗体scfv的氨基酸序列如seq id no.1所示。

3.根据权利要求1所述的抗原受体，所述信号肽的氨基酸序列如seq id no.3；cd8hinge的氨基酸序列如seq id no.5；cd28跨膜区、cd28胞内结构域的氨基酸序列分别如seq id no.7、seq id no.9所示；胞内共刺激域4-1bb的氨基酸序列如seq id no.11；cd3ζ的氨基酸序列如seq id no.13所示。

4.根据权利要求1所述的抗原受体，所述p2a蛋白的氨基酸序列如seq id no.15所示；所述fosb蛋白的氨基酸序列如seq id no.17所示。

5.一种重组嵌合型抗原受体的基因载体，其特征在于，以ptk881-ef1α载体为骨架，插入权利要求1-4任意一项所述的嵌合型抗原受体编码核苷酸序列的慢病毒、逆转录病毒或转座子载体。

6.一种表达嵌合型抗原受体的免疫细胞，其特征在于，由权利要求1-4任意一项所述嵌合型抗原受体的编码核苷酸序列或权利要求5所述重组嵌合型抗原受体基因载体转染免疫细胞得到，所述免疫细胞选自脐带血、外周血、肿瘤组织或ipsc来源的t细胞、nk细胞、nkt细胞、αβt细胞、γδt细胞、cd4+t细胞，cd8+t细胞。

7.权利要求6所述的免疫细胞的用途，所述免疫细胞用于制备治疗表达肿瘤抗原的肿瘤治疗，更优选的，免疫细胞用于治疗表达cd19抗原的肿瘤治疗。

8.根据权利要求7所述的应用，所述肿瘤选自急性淋巴细胞白血病或弥漫性大b细胞淋巴瘤。

9.权利要求7所述的免疫细胞的用途，所述免疫细胞用于过表达fosb和分泌颗粒酶b。

技术总结
本发明公开了一种共表达FOSB的嵌合抗原受体及其应用，所述嵌合型抗原受体从N端到C端顺次拼接信号肽、靶向CD19的单链抗体ScFv、strepII、CD8hinge、CD28跨膜区、CD28胞内结构域、胞内共刺激域4‑1BB和CD3ζ链；在CD3ζ链的C端进一步拼接有P2A肽和FOSB。以CD19抗体为例，共表达FOSB的抗CD19嵌合抗原受体用于修饰免疫细胞，修饰后的免疫细胞对肿瘤细胞的杀伤优于普通的Anti‑CD19CAR‑T细胞。

技术研发人员：张同存
受保护的技术使用者：武汉波睿达生物科技有限公司
技术研发日：
技术公布日：2024/1/14