本发明属于微生物培养，具体涉及一种龋齿致病产酸菌厌氧培养基及其制备方法。
背景技术：
1、目前公认的龋病病因学说是四联因素学说，主要包括细菌、口腔环境、宿主(即指寄生物包括寄生虫、病毒等寄生于其上的生物体)和时间。其基本点为：致龋性食物糖(特别是蔗糖和精制碳水化合物)紧紧贴附于牙面，由唾液蛋白形成的获得性膜。这种获得性膜不仅得以牢固的附着于牙面，而且可以在适宜温度下，有足够的时间在菌斑深层产酸，侵袭牙齿，使之脱矿，并进而破坏有机质，产生龋洞。
2、导致龋齿的主要细菌有:变形链球菌、血链球菌、唾液链球菌以及乳酸杆菌。这些细菌都一个共同特点是能产酸，分解口腔的一些糖分，形成一些酸性代谢产物，这些酸性的代谢产物对牙齿表面的形成脱矿，从而也破坏牙齿造成龋齿。还有一个特点是这些细菌都有耐酸性，在酸性的环境下它其实可以存活的更好。
3、口腔中所有部位均能分离出链球菌，该菌群多数为g+兼性厌氧菌。导致龋病的主要链球菌有：变形链球菌、血链球菌、唾液链球菌。
4、变形链球菌：为革兰染色阳性的球菌，是口腔天然菌群中占比例最大的链球菌属中的一种。变形链球菌有强的致龋性主要取决于其产酸性和耐酸性。在菌斑中生存的变形链球菌能迅速发酵多种碳水化合物产生多量酸，变形链球菌能以蔗糖为底物合成胞外葡聚糖、果聚糖及胞内多糖。葡聚糖介导细菌的黏附，促进菌斑的形成，是变链球菌重要的致龋毒力因子。
5、血链球菌：是最早在牙面定居的细菌之一。该菌与变形链球菌一样，能利用蔗糖合成水溶性与水不溶性细胞外多糖。这些细菌对牙菌斑形成和细菌在硬组织上聚集有重要作用。
6、唾液链球菌：此病菌属于产酸菌属，在人体的口腔中，通常会持续的产生酸，加快牙齿表面脱矿，进而破坏牙齿，诱发龋齿。
7、乳酸杆菌是口腔的正常菌群，为革兰阳性兼性厌氧或专性厌氧杆菌。乳酸杆菌可分为两类：一类为同源发酵菌种，利用葡萄糖发酵后主要产生乳酸。这组的代表为干酪乳杆菌和嗜酸乳杆菌，它们与龋病密切相关。另一类为异源发酵菌种，发酵后产生乳酸和较大量的乙酸、乙醇和co2，其代表为发酵乳杆菌。在唾液样本中最常分离到的菌种是嗜酸乳杆菌，在牙菌斑中最常见的是发酵乳杆菌。
8、放线菌是口腔正常菌群中最常见的g+不具动力、无芽胞形成的杆状或丝状菌。在口腔内发现的放线菌种可分为两类。一类为兼性厌氧菌，包括内氏放线菌和黏性放线菌。另一类为专性厌氧菌，包括依氏放线菌、迈氏放线菌和溶牙放线菌。所有放线菌均能发酵葡萄糖产酸，主要产生乳酸，少量乙酸和琥珀酸等。目前普遍认为，放线菌的生物学性能说明该菌可能与致龋性有关。黏性放线菌促进变形链球菌定殖于根面，对根面菌斑形成及根面龋的发生可能有重要的协同作用。
9、总之，齿致病产酸菌大多数为兼性厌氧菌或专性厌氧菌，本发明的龋齿致病产酸菌厌氧培养基配方简单，培养增菌快，非常适用于口腔或牙齿表面样本的产酸菌培养，可以初步评估龋病风险(cariostat分度值)。
技术实现思路
1、本发明为微生物培养与检测技术领域，具体涉及一种龋齿致病产酸菌厌氧培养基及其制备方法；本发明提供了一种龋齿致病产酸菌厌氧培养基及其制备方法，可以有效地应用于龋病患者口腔中提取的检测样本致病产酸菌的增菌培养。由于培养基中含有酸碱指示剂，可以在致病产酸菌增菌培养过程中发生颜色变化，便于判断致病产酸菌的高低含量，进而初步评估龋病风险(cariostat分度值)。
2、本发明提供一种龋齿致病产酸菌厌氧培养基及其制备方法。本发明依据细菌培养的特殊要求，用于牙齿和口腔部位细菌的培养时，以蛋白胨为氮源，蔗糖为碳源，当细菌大量繁殖时可将蔗糖转化为酸性物质，此时培养基的ph值就会发生改变，在溴甲酚绿/溴甲酚紫存在的情况下发生培养基颜色的变化，从而可以判定样本中细菌的含量，预估患龋齿的风险。优选的，培养基组分包含产酸菌生长所需的完整营养成分，即蛋白胨、蔗糖、氯化钠、维生素c、水；另，包含有产酸显色，如溴甲酚绿、溴甲酚紫，便于培养基变色的观察；同时包含有提供厌氧培养环境的苯乙醇，防止好氧菌的生长。
3、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧其培养基各组分配比：蛋白胨0.5-5％、蔗糖1-10％、氯化钠0.1-0.6％、溴甲酚绿0.1-0.3％、溴甲酚紫0.01-0.15％、维生素c 0.01-0.05％、吐温-80 0.01-0.06％、苯乙醇0.01-0.25％、去离子水，为液体培养基。
4、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基包括细菌生长所需的优质氮源，即蛋白胨，其在培养基中含量为0.5-5％。
5、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基包括细菌生长所需的优质碳源，即蔗糖，蔗糖不仅是细菌培养所需的碳源，也是拟致龋性食物糖，当培养基接种口腔样本或标准菌株(如变形链球菌)时，可以转化蔗糖为酸性物质(产酸)，此时培养基的ph变化会显示颜色的变化，其在培养基中含量为1-10％。
6、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基包括细菌生长所需的辅助组分，包括氯化钠、维生素c及吐温-80，所述氯化钠在培养基中含量为0.1-0.6％；所述维生素c在培养基中含量为0.01-0.05％，所述吐温-80在培养基中含量为0.01-0.06％。
7、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基包括产酸指示剂，即溴甲酚绿与溴甲酚紫。溴甲酚绿颜色变化由黄色(ph＝3.8)至蓝绿色(ph＝5.4)，当ph＝4.5时颜色变化明显，对碱很敏感，遇碱性水溶液呈特殊的蓝绿色。溴甲酚紫颜色变化由浅黄色至紫红色，变色范围的ph值为5.2-6.8，适量使用可补充颜色变化的色阶。所述溴甲酚绿与溴甲酚紫在培养基中含量分别为0.05 -0.3％与0.01-0.15％。
8、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基包括提供厌氧培养环境的苯乙醇，可以有效地抑制好氧微生物的生长，促进厌氧/兼性厌氧微生物生长。所述苯乙醇在培养基中含量为0.01-0.25％。
9、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基的制备方法包括以下步骤：称取溴甲酚绿、溴甲酚紫，溶解于少量无水乙醇中备用；称取蛋白胨溶解于去离子水中，然后分别称量加入蔗糖、氯化钠、维生素c和吐温-80，搅拌溶解充分混匀，121℃高压蒸汽灭菌20-30分钟，冷却至室温，加入经0.22um超滤膜过滤的苯乙醇，即为所述的龋齿致病产酸菌厌氧培养基。
10、优选的，所述龋齿致病产酸菌厌氧培养基的制备方法及其应用，所述培养基在检测口腔或牙齿龋齿致病产酸菌中的应用，包括以下步骤：
11、(1)口腔或牙齿取样后，快速地接种于培养基中；
12、(2)接种后的培养管置于37±1℃的恒温培养箱中孵育48小时；
13、(3)取出培养管，依据培养基颜色变化，评估龋齿风险(cariostat分度值)。如，龋齿风险评分(0)：未检出龋齿微生物生长；龋齿风险评分(1)：有微量龋齿微生物生长；龋齿风险评分(2)：有少量龋齿微生物生长，龋齿易感性高；龋齿风险评分(3)：有大量龋齿微生物生长和较高龋齿风险。
14、获取临床口腔样本，接种于本发明的龋齿致病产酸菌厌氧培养基中，放入在37℃恒温培养箱中孵育48小时，依据培养基颜色的变化，判断临床口腔样本中致病菌的浓度。口腔及牙齿表面的致病菌种类较多，龋病致病菌主要包括变形链球菌、放线菌和乳杆菌等种类。它们通过分解营养物质，尤其时致龋性食物糖(特别是蔗糖和精制碳水化合物)，产生大量的有机酸，酸性物质可以改变培养基的酸碱性，酸碱指示剂将会发生显色变化，从而可以判断致病菌的浓度。
15、本发明通过培养基的颜色变化判断龋齿致病产酸菌的含量浓度高低，依据cariostat分度值评分标准，可分为4级：
16、1.龋齿风险评分(0)：未检出龋齿微生物生长。即当培养基颜色为蓝色时，说明临床样本中的龋齿致病产酸菌含量低，口腔状态健康；2.龋齿风险评分(1)：有微量龋齿微生物生长。即当培养基颜色变为蓝绿色时，说明临床样本中的龋齿致病产酸菌含量已经有引起龋病的风险，需要接受专业口腔护理，间隔一段时期后需要再次进行龋齿风险；
17、3.龋齿风险评分(2)：有少量龋齿微生物生长，龋齿易感性高。即当培养基颜色变为绿色时，说明临床样本中的龋齿致病产酸菌的含量较高，患龋齿的风险较高，需要进行治疗；
18、4.龋齿风险评分(3)：有大量龋齿微生物生长和较高龋齿风险。即当培养基颜色变为黄绿色或浅黄色时，说明临床样本中的龋齿致病产酸菌大量生长，或已经出现龋齿，龋齿的风险非常高或将加重病情，需要进行及时的良好的治疗。