专利名称:新型热带假丝酵母cj－fid(kctc 10457bp)及用其制造木糖醇的方法
技术领域：
本发明涉及一种新型热带假丝酵母CJ-FID和一种用其制造生产木糖醇的方法。更具体来说，本发明涉及一种从蜂蜜中得到的热带假丝酵母CJ-FID，以及一种高产量和高产率地生产高纯度木糖醇的方法，其中包括培养该热带假丝酵母本身或者培养在含有高浓度木糖和蔗糖的发酵培养基中的海藻酸盐固定化热带假丝酵母CJ-FID来获得含木糖醇的培养物，之后用活性炭柱和阴离子柱纯化，最终获得粉末状的木糖醇。
背景技术：
木糖醇是一种糖醇，通过氢化作用将作为五碳糖的木糖的还原性末端基团转化为醇基而制成，其在天然植物，如水果、蔬菜和蘑菇中少量存在。已经知道木糖醇是哺乳动物碳水化合物代谢中的中间产物。由于其化学结构的缘故木糖醇比其它的糖类更加稳定，有高度的亲水性，而且不会发生褐变反应。
木糖醇的甜度和蔗糖相当，但是卡路里含量低并且不会引起血糖升高或龋齿。在这方面，木糖醇作为糖的替代品而非常流行(McNutt K.，A.Sentki.1996.Sugar replacersa growing group of sweeteners in the UnitedStates.Nutr.Today.31(6)255-261)。木糖醇在人的肠道中通过主动扩散而被吸收。然而，由于吸收率很低，未被肠道完全吸收的木糖醇被排出体外。被吸收的木糖醇通过肠道微生物的作用而部分降解掉了，在人体中利用的只有一小部分。在这点上，木糖醇成为了低卡路里的甜味剂。
特别是，由于其被细胞组织吸收时不需要胰岛素，因此木糖醇被用作糖尿病患者的糖替代物。此外，因为其甜度与蔗糖相当并且其能抵消热量耗散，因此木糖醇可在口腔内引起清凉和清新的感觉。因而，木糖醇被用于各种食品工业中，包括糖果食品和口香糖。此外，它通过抑制引起龋齿的变异链球菌(Streptococcus mutans)的生长，可防止产生龋齿，并因而被用作牙膏的原料。
木糖醇存在于蔬菜或水果中，但是由于其含量很低，从这些来源中提取木糖醇不经济。因此，人们主要采用木糖醇的化学制品。依照该化学制备方法，在高温高压条件下通过将存在于木头、稻草、小米等等中的半纤维素的水解产物木糖进行化学还原可制备木糖醇。然而，从来自于半纤维素片段的其它聚合物糖类的水解产物中分离和纯化木糖或木糖醇很困难，并且木糖和木糖醇的收率仅有50-60％。而且，还存在高温高压反应的风险和由于使用酸或碱造成的废料处理问题。
利用微生物作为生物催化剂将木糖培养基中的木糖转化成木糖醇也是公知的。也就是说，在微生物中，在木糖培养基中的木糖被跨细胞膜运输，然后通过NADPH辅酶依赖型木糖还原酶(XR)转化成木糖醇。从微生物细胞中释放出大量积聚的木糖醇。利用微生物得到的木糖醇产物的优点在于，不需要从木糖中分离木糖醇，因为在发酵之后木糖被完全消耗掉了，并且采用的条件温和，例如室温和大气压。然而，由于难以高效并有选择性地去除副产物，如有机酸和甘油、介质成分、以及通常包含在发酵介质中的来自于微生物的物质，因而难以纯化出高纯度的木糖醇，导致了产率较低。
已公开的公开号为No.10-2001-49918的韩国专利公开了一种利用氧化葡萄糖酸杆菌(Gluconobacter oxydans)ATCC 621从阿拉伯糖醇制备木糖醇的方法。根据该专利文件中的公开内容，从200ml 45g/L最终得到的木糖醇溶液中纯化出木糖醇。然而，该文件并没有公开一个准确的纯化收率结果。而且，由于木糖醇从低浓度(50g/L)的溶液中制得，所以不能确保高浓度和高效的木糖醇生产。近来，为了解决这些问题，人们针对新型酵母菌株的分离和利用该新型酵母菌株来制备木糖醇的方法进行了许多研究。
发明内容
鉴于这些问题，本发明提供了一种新型热带假丝酵母CJ-FID。本发明还提供了一种高收率和高产率地生产高纯度木糖醇的方法。
下文中将通过本发明的实施例来实现本发明的上述以及其它的目的。
因此，根据本发明的一个方面，提供了一种产木糖醇的热带假丝酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)。
根据本发明的另一个方面，提供了一种海藻酸盐凝胶珠，其制备是通过将热带假丝酵母加入到褐藻酸水溶液，搅拌得到均匀溶液，并将该均匀溶液滴加到钙盐中而得到。
根据本发明的另一个方面，提供了一种制备木糖醇的方法，包括制备含木糖和蔗糖的产木糖醇发酵培养基，将含有热带假丝酵母CJ-FID的海藻酸盐凝胶珠接种到发酵培养基上，并在发酵罐中使该发酵培养基发酵。
该方法可进一步包括用活性炭柱纯化经过发酵过程产生的含木糖醇的发酵培养物，用阴离子柱纯化所述纯化过程产生的木糖醇溶液，并由所述阴离子柱纯化制得的木糖醇溶液来制备木糖醇粉末。
在下文中，将对本发明进行更详细的说明。
产木糖醇的酵母菌株的分离从国内产蜂蜜的地区采得天然蜂蜜样品并在消毒试管中适当地稀释。在30℃下在含有200-400g/L木糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、以及15-20g/L琼脂的平板培养基中培养稀释的蜂蜜样品，从而获得在上述生长条件下快速生长的酵母株系形成的单个的菌落。
产木糖醇酵母株系的鉴定从这些菌落中，选择出在上述生长条件下具有优良的耐糖性和木糖醇产率的酵母株系，并分析其形态和生理学特性。通过26S rRNA测序的结果发现，该酵母株系具有如SEQ ID NO1种所列出的核苷酸序列。该酵母株系被命名为热带假丝酵母CJ-FID，并存放在韩国生命科学和生物技术研究所的Gene Bank中(登录号KCTC 10457BP)。
木糖醇产率的计算对所选择的酵母株系的木糖醇产率进行计算，将所选的酵母株系接种到装在250mL烧瓶中的50mL种培养基中，其中含有20g/L木糖、5g/L酵母提取物、5g/L蛋白胨、以及2g/L蔗糖，然后以200rpm的转速在30℃下振荡培养12小时。然后，将5％的种培养基接种到装在500mL烧瓶中的100mL主培养基中，其中含有100g/L的木糖、5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、以及10g/L的蔗糖，然后以150rpm的速度在30℃下振荡培养42小时。以一定的时间间隔从产物培养物中取得培养物样品，然后测定每个培养物样品中的木糖醇产物。
木糖和木糖醇分析为了分析木糖和木糖醇，将前一节中取得的培养物样品以12000rpm的转速离心去除细胞。利用具有Kromasil 100-10NH2柱(Denmark)的高效液相色谱(HPLC Shimadzu，Japan)的折射率检测器(ShimadzuC-R6A，Japan)分析上清液。此时，溶剂为90％的乙腈，流速为2.0mL/min。利用浊度剂测定600nm处的光密度来计算酵母的细胞密度，并将该值与先前制成的光密度与细胞干重之间关系的标准曲线相比较。
热带假丝酵母CJ-FID的固定为了制备固定化的细胞，先制备在食品中使用的海藻酸溶液(3％，w/v)。然后将相同浓度的细胞浓缩物加入到其中并且搅拌。在胶珠产生器中将所得到的溶液滴加到100mM的氯化钙溶液中形成海藻酸盐凝胶珠。将由此形成的海藻酸盐凝胶柱在4℃下储存12小时以便提高海藻酸盐凝胶珠的强度用于后续试验。
通过热带假丝酵母CJ-FID得到的发酵木糖醇将含有木糖、0.1-10g/L的酵母提取物、0.1-10g/L的蛋白胨、以及0.1-50g/L蔗糖的发酵培养基引入发酵罐中。然后，将热带假丝酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)本身或者海藻酸盐固定化热带假丝酵母CJ-FID接种到发酵培养基上，速度为0.5-2vvm的通风条件下以200-300rpm的转速以及25-35℃的温度下培养60至100小时。培养之后，将发酵培养物离心去除细胞，并从上清液中回收木糖醇。
优选地，发酵培养基中所含的木糖醇的量在50至200g/L，更优选在80至150g/L。如果木糖醇的含量少于50g/L，则可能降低木糖醇的产量。另一方面，如果其超出了200g/L，则产量提高可能并不显著。为了提高产量，可以在发酵培养基中补充0.1-5g/L的磷酸二氢钾(KH2PO4)以及0.5-5g/L的硫酸镁(MgSO4)。
木糖醇发酵培养物的纯化为了将前一节中获得的发酵培养物制备成高纯度的木糖醇粉末，可将300g的活性炭填入柱(高度60cm×直径10cm)中，然后使发酵培养物通过该柱从而获得去除异味并脱色的含木糖醇馏分。使获得的含木糖醇的馏分通过装填了阴离子树脂的阴离子柱(高度60cm×直径10cm)以去除杂质。通过HPLC分析所得到的含木糖醇的馏分。结果，在含木糖醇的馏分中得到纯的木糖醇。
在浓缩器中将含木糖醇的馏分浓缩至800g/L以上并在4℃下结晶，接着搅拌并加入乙醇得到优质的木糖醇晶体。真空过滤木糖醇晶体以部分去除乙醇和水。最后，通过真空干燥器去除残余的乙醇和水得到木糖醇粉末。
图1是表示木糖醇产率与初始木糖浓度关系的曲线图。
图2是表示木糖醇产率与初始细胞浓度关系的曲线图。
图3是表示木糖醇产率和收率与海藻酸盐固定化细胞的密度的关系曲线图。
图4是表示木糖醇产率和收率与海藻酸盐凝胶珠质量的关系曲线图。
图5是表示木糖醇产率和收率与被海藻酸盐固定化的酵母细胞的种培养时间的关系曲线图。
图6是表示木糖醇产率和收率与设置在优化发酵条件下的海藻酸盐固定化酵母细胞在2L发酵罐中的发酵时间的关系曲线图。
图7是表示木糖醇产率和收率与设置在优化发酵条件下的海藻酸盐固定化酵母细胞在17L发酵罐中的发酵时间的关系曲线图。
图8是表示通过应用含木糖醇培养物而获得的含木糖醇馏分的木糖醇浓度变化与活性炭柱的曲线图。
图9是表示由图8的应用获得的含木糖醇馏分的木糖醇浓度变化与阴离子柱的曲线图。
图10是图9馏分的高效液相色谱图(HPLC)。
图11是表示以不同浓度浓缩的图9馏分的木糖醇结晶产率。
实施本发明的最佳方式在下文中，将通过实施例更加详细地说明本发明。然而，以下的实施例仅作为说明性的目的提供，因此本发明并不仅限于此或者受其限制。
木糖醇产率与初始木糖浓度的关系如上所述进行了种培养之后，将种培养物接种到10L产木糖醇的主培养基上，其主培养基含有0.5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、10-30g/L的蔗糖，以及100-300g/L的木糖、并在15L的发酵罐(Korea FermentationCo.，Ltd)中培养。发酵条件如下搅拌速度250rpm，通风流动速度1.0vvm，培养温度30℃。测定木糖醇产率与初始木糖浓度的关系，结果如图1中所示。
如图1所示，木糖醇的最大产量为187g/L。此时，木糖醇的收率为优，达93.5％。可以看出，增加蔗糖会提高木糖醇的收率。
木糖醇产率与初始细胞密度的关系如上所述进行了种培养之后，将种培养物接种到10L产木糖醇的主培养基上，其主培养基中含有5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、10g/L的蔗糖，以及100g/L的木糖，并在15L的发酵罐(Korea FermentationCo.，Ltd)中培养。发酵条件如下搅拌速度250rpm，通风流动速度1.0vvm，培养温度30℃。测定木糖醇产率与初始细胞密度的关系，结果如图2中所示。
如图2所示，木糖醇的最大产量为132g/L。此时，木糖醇的收率为优，达98％。然而可以看出，使用高浓度的木糖会减缓木糖醇生产速率。
对常规产木糖醇株系与热带假丝酵母CJ-FID(KCTC10457BP)的糖耐受性测试计算根据本发明的热带假丝酵母CJ-FID和常规的产木糖醇株系的糖耐受性，计算值列于以下的表1中。
表1产木糖醇酵母株系的糖耐受性测试结果
(+++生长极好，++生长良好，+少许生长，-不生长)从表1可以看出，与当前已知的酵母株系相比，本发明的热带假丝酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)表现出极好的木糖耐受性。这意味着本发明的热带假丝酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)可在含高浓度木糖的培养基中大规模地生产木糖醇。
计算木糖醇产率与海藻酸盐固定化细胞密度的关系为了计算木糖醇产率与海藻酸盐凝胶珠固定化的热带假丝酵母细胞的关系，在进行如上所述的种培养之后，可通过将海藻酸盐溶液与不同细胞密度(10到100(OD值))的种培养物混合来制备海藻酸盐凝胶珠。然后，将该海藻酸盐凝胶珠接种到10L产木糖醇的主培养基上，其中含有5g/L的酵母提取物，5g/L蛋白胨、10g/L的蔗糖，以及100g/L的木糖，并在15L的发酵罐(Korea Fermentation Co.，Ltd)中培养。发酵条件如下搅拌速度250rpm，通风流动速度1.0vvm，培养温度30℃。测定木糖醇产率与初始细胞密度的关系，结果如图3中所示。
如图3所示，当细胞密度在10到20(OD值)时，木糖醇产率大约为0.5g/L.H。在细胞密度大于50(OD值)时，木糖醇的产率大于1.25g/L.H。在细胞密度为100(OD值)时，木糖醇产率达到最大值1.65g/L.H。
计算木糖醇产率与海藻酸盐凝胶珠质量的关系通过与实施例4中相同的方式制备海藻酸盐凝胶珠，将其以不同的质量(2.5到50g)接种到装在2L发酵罐中的产木糖醇发酵培养基上，并在与实施例4相同的发酵条件下培养。测定木糖醇产率与海藻酸盐凝胶珠质量的关系，结果如图4种所示。
如图4所示，无论海藻酸盐凝胶珠的质量如何改变，木糖醇的产率都保持恒定。
计算木糖醇产率与种培养时间的关系为了计算木糖醇产率与用于制备海藻酸盐凝胶珠的种培养细胞的种培养时间的关系，可在种培养基中将酵母株系培养不同的时间(12到60小时)然后在与实施例4相同的发酵条件下进行发酵。测定木糖醇产率与种培养时间的关系，结果如图5中所示。
如图5所示，无论种培养时间如何，木糖醇的产率都保持恒定。然而，种培养24小时的酵母株系表现出最高的木糖醇产率。
计算木糖醇产率和收率与重复使用固定化细胞的关系制备海藻酸盐凝胶珠固定化的热带假丝酵母CJ-FID，并以与实施例4相同的方式发酵，除了该海藻酸盐凝胶珠重复使用之外(一次到五次)。通过与当前已知的高里海藻酸盐凝胶珠固定化假丝酵母FTI 20037的产率相比较，计算木糖醇产率和收率与海藻酸盐凝胶珠固定化的热带假丝酵母CJ-FID的关系，结果列于表2中。
表2木糖醇产率和收率与重复使用固定化细胞的关系
如表2所示，甚至当固定化细胞使用了五次时，也没有观察到木糖醇的产率和收率有所降低。特别是，与高里假丝酵母FTI 20037相比，热带假丝酵母CJ-FID细胞表现出高出五倍的木糖醇产率，收率高出45％以上。
木糖醇产率与发酵时间的关系制备海藻酸盐凝胶珠固定化的热带假丝酵母CJ-FID，并在2L和17L的发酵罐中以相同于实施例4的方式进行发酵。通过不同的发酵时间测定木糖醇产率，结果如图6和7所示。
如图6和7所示，木糖醇浓度在发酵6小时后增加。对于2L发酵罐中的发酵(图6)，木糖醇产率在发酵24小时时达到最大值。对于17L发酵罐中的发酵(图6)，木糖醇产率在发酵36小时时达到最大值。
木糖醇发酵培养物的纯化测定通过了活性炭柱和阴离子柱的木糖醇发酵培养物馏分中的木糖醇浓度。结果如图8和9中所示。通过高效液相色谱法(HPLC)分析图9中的馏分，结果如图10中所示。将图9的馏分浓缩成不同的浓度，然后测定木糖醇结晶收率与浓度的关系。结果如图11中所示。
根据利用活性炭柱的纯化结果，如图8中所示，馏分4表现出最高的木糖醇浓度。根据利用活性炭柱和阴离子柱的纯化结果，如图9中所示，馏分3至5表现出最高的木糖醇浓度。从图10的色谱图可以看出，通过了活性炭柱和阴离子柱的馏分含有高度纯化的木糖醇。将纯化的木糖醇溶液结晶成不同的浓度。随着木糖醇溶液浓度的增加，木糖醇结晶产量成比例地增加。
按照木糖醇发酵和纯化得到的木糖醇浓度和收率在发酵和纯化之后，测定的木糖醇浓度和收率，归纳在下表3中。
表3根据木糖醇发酵培养物的纯化过程得到的纯化收率
如表3中所示，发酵和纯化之后，木糖醇的最终收率高达77.4％，并且在各纯化过程中只观察到极少的木糖醇损耗量。
工业实用性通过上述说明，显然本发明的新型热带假丝酵母CJ-FID(KCTC10457BP)以及用其制造木糖醇的方法在优化的培养条件和培养基的组成下，可以以高收率和产率生产高纯度的木糖醇。
尽管本发明是根据示例性实施例及其实验性实例来进行详细的表示和说明的，但本领域普通技术人员应当明白，只要不偏离由以下权利要求
所限定的本发明的实质和范围，其中可以做出各种形式和细节上的改变。
序列表FP06KR076SEQUENCE LISTING<110>CJ株式会社(CJ Corp.)<120>新型热带假丝酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)及用其制造木糖醇的方法<130>FP06KR079<140>PCT/KR2004/001172<141>2004-05-18<150>KR10-2003-0051593<151>2003-07-25<150>KR10-2004-0033733<151>2004-05-13<160>1<170>PatentIn version 3.3<210>1<211>576<212>DNA<213>热带假丝酵母(Candida tropicalis)<400>1ataccaacag ggattgcctt agtagcggcg agtgaagcgg caaaagctca aatttgaaat 60ctggctcttt cagagtccga gttgtaattt gaagaaggta tctttgggtc tggctcttgt 120ctatgtttct tggaacagaa cgtcacagag ggtgagaatc ccgtgcgatg agatgatcca 180ggcctatgta aagttccttc gaagagtcga gttgtttggg aatgcagctc taagtgggtg 240gtaaattcca tctaaagcta aatattggcg agagaccgat agcgaacaag tacagtgatg 300gaaagatgaa aagaactttg aaaagagagt gaaaaagtac gtgaaattgt tgaaagggaa 360gggcttgaga tcagacttgg tattttgtat gttacttctt cgggggtggc ctctacagtt 420tatcgggcca gcatcagttt gggcggtagg agaattgcgt tggaatgtgg cacggcttcg 480gttgtgtgtt atagccttcg tcgatactgc cagcctagac tgaggactgc ggtttatacc 540taggatgttg gcataatgat cttaagtcgc ccgtct 576
权利要求
1.一种产木糖醇的热带假丝酵母CJ-FID(KCTC 10457BP)。
2.一种海藻酸盐凝胶珠，其制备是通过将热带假丝酵母加入到海藻酸的水溶液中，搅拌得到均匀溶液，并将该均匀溶液滴加到钙盐中而得到。
3.一种制备木糖醇的方法，其特征在于包括制备含木糖和蔗糖的产木糖醇发酵培养基；将权利要求
2的海藻酸盐凝胶珠接种到所述发酵培养基上；以及在发酵罐中使所述发酵培养基发酵。
4.根据权利要求
3的一种制备木糖醇的方法，其特征在于进一步包括用活性炭柱纯化通过发酵过程产生的含木糖醇的发酵培养物；用阴离子柱纯化所述活性炭柱纯化过程产生的木糖醇溶液；以及由所述阴离子柱纯化制得的木糖醇溶液来制备木糖醇粉末。
专利摘要
提供了一种从蜂蜜中得到的新型热带假丝酵母CJ－FID(KCTC10457BP)以及用其制备木糖醇的方法。该方法包括培养该热带假丝酵母CJ－FID本身或者培养在含有高浓度木糖和蔗糖的发酵培养基中的海藻酸盐固定化热带假丝酵母CJ－FID来获得含木糖醇的培养物，之后用活性炭柱和阴离子柱纯化，最终获得粉末状的木糖醇。因此，可以以高收率和产率制备高纯度的木糖醇。
文档编号C12P7/02GKCN1829790SQ200480021548
公开日2006年9月6日 申请日期2004年5月18日
发明者金政勋, 孙永録, 李苑和, 朴承源, 朴康浚, 李起昌, 林栽珏 申请人:Cj株式会社导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan