控制对盐胁迫的耐受性的新的水稻基因的制作方法

专利名称:控制对盐胁迫的耐受性的新的水稻基因的制作方法
技术领域：
本发明涉及新的基因。更具体地，本发明涉及编码蛋白质的新基因，所述蛋白质具有控制植物对盐胁迫的耐受性的功能。
背景技术：
植物经常遭受胁迫，甚至在正常生长环境下也是如此。所述胁迫包括以下多种盐，干旱，高温，低温，强光，空气污染等。在农业生产方面，盐胁迫受到人们的关注。当土壤和石块分解时，就会产生盐，并且会持续不断地产生盐。下雨时盐流入河流或大海中。在降雨稀少的沙漠地带，仅有少量的盐流出，使得土壤水分中的盐浓度相当高。植物在通过根渗透吸收水分的同时也在吸收盐(营养物质)。当盐浓度高时，植物无法吸收水分。另外，由于离子特异性的生理作用，植物的生长受到抑制。已知植物对盐胁迫的反应与其对环境胁迫，如干旱，高渗透压，低温等的反应部分一致。这些胁迫对农业造成相当严重的损害。
最近，由于大量使用化学肥料或长期连续耕作，经常能观察到土壤中积累了高浓度的盐。特别是在温室土壤中，经常会发生有害的盐积累。在靠近海岸的地区，海水或海风导致损害。在干旱或半干旱地区，由于过度蒸发，盐积累在土壤表层。这些问题限制了农业用地的使用。解决这些问题的通常做法是更换受影响的土壤，或通过灌溉除去盐。然而，这些方法需要耗费大量财力或人力。通过灌溉除去盐导致大量盐水流入周围地区，会引起环境污染。目前已考虑限制灌溉。
因此，寻找能耐受盐胁迫的植物是非常重要的。
根据国内外进行的对盐耐受植物的研究，已知当将盐耐受植物从非-胁迫条件下转移至盐胁迫条件时，可诱使新基因表达，这些基因的产物对盐胁迫耐受性起作用。已知在烟草属植物中，有一些植物类型具有盐胁迫耐受性。据报道已分离出相关基因(Nelson等，(1992)Plant Molecular Biology，vol.19，577-588；Yun等，(1996)Plant Physiology，vol.111，1219-1225)。烟草属植物的另一例与盐胁迫反应有关的基因是得自具有盐胁迫耐受性的Nicotianapaniculata的基因，所述基因描述于日本特许公开号11-187877，日本特许公开号11-187878，日本特许公开号11-187879和日本特许公开号11-187880。日本特许公开号11-187877描述了由盐胁迫诱导的新基因。据认为由该基因编码的基因产物具有赋予植物水应力耐受性的功能。日本特许公开号11-187878描述了由盐胁迫诱导的新的钾通道基因。据认为由该基因编码的钾通道基因具有赋予植物水应力耐受性的功能。日本特许公开号11-187879描述了由盐胁迫诱导的新的INPS基因。由该基因编码的INPS基因具有赋予植物水应力耐受性的功能。日本特许公开号11-187880描述了由盐胁迫诱导的新的叶绿体型果糖二磷酸醛缩酶。据认为由该基因编码的醛缩酶具有赋予植物水应力耐受性的功能。
两种与对盐胁迫的反应有关的水稻基因是叶绿体谷氨酰胺合成酶(GS2)基因(Hoshida等，Plant Mol.Biol.43103-11(2000))；和Δ1-吡咯啉-5-羧酸(P5C)合成酶(OsP5CS)基因(Igarashi等，Plant Mol.Biol.33857-65(1997))。在上述文献中，描述了GS2基因可增强光呼吸能力，从而赋予植物对盐胁迫的耐受性。高浓度的盐，脱水作用，脱落酸处理和低温可诱导与脯氨酸生物合成有关的OsP5CS基因。在盐耐受品种Dee-gee-woo-gen中，OsP5CS基因的表达在盐胁迫条件下稳定增加，而在对盐敏感的品种IR28中，所述表达略有增加。
利用水稻逆转录转座子Tosl7的特性已产生多个基因被破坏的水稻株系，所述转座子通过培养被激活以经受转座。转座子是遍布于动物，酵母，细菌和植物基因组的致突变基因。根据转座子的转座机理，可将其分成两类。II类转座子以不复制的DNA形式经受转座。II类转座子的例子包括玉米的Ac/Ds，Spm/dSpm和Mu元件(Fedoroff，1989，Cell 56，181-191；Fedoroff等，1983，Cell 35，235-242；Schiefelbein等，1985，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82，4783-4787)，以及金鱼草属(Antirrhinum majus)的Tam元件(Bonas等，1984，EMBO J，3，1015-1019)。II类转座子被广泛用于利用转座子标记进行基因分离。所述技术利用了转座子的特性，即转座子在基因组内转座，并插入某个基因，结果，在生理学和形态学上修饰了该基因，从而改变由该基因控制的表型。如果可以检测到这种表型变化，即可分离出受影响的基因(Bancroft等，1993，The Plant Cell，5，631-638；Colasanti等，1998，Cell，93，593-603；Gray等，1997，Cell，89，25-31；Keddie等，1998，The Plant Cell，10，877-887；和Whitham等，1994，Cell，78，1101-1115)。
I类转座子也被称为逆转录转座子。逆转录转座子以RNA作为中间体经受复制型转座。最初，在果蝇和酵母中鉴定出I类转座子。最新的研究揭示出逆转录转座子在植物基因组中普遍存在并且占有优势(Bennetzen，1996，Trends Microbiolo.，4，347-353；Voytas，1996，Science，274，737-738)。大多数逆转录转座子似乎都是可整合但不可转座的单位。最近，据报道一些这种类型的逆转录转座子在胁迫条件下可被激活，所述条件如损伤，病原体攻击和细胞培养(Grandbastien，1998，Trends in Plant Science，3，181-187；Wessler，1996，Curr.Biol.，6，959-961；Wessler等，1995，Curr Opin.Genet.Devel.，5，814-821)。例如，在烟草逆转录转座子TntlA和Ttol(Pouteau等，1994，Plant J.，5，535-542；Takeda等，1988，Plant Mol.Biol.，36，365-376)以及水稻逆转录转座子Tosl7(Hirochika等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，7783-7788)中发现了胁迫条件下的激活。
水稻逆转录转座子Tosl7是已被深入研究的植物I类元件。使用根据Tyl-copia组逆转录-元件的逆转录酶结构域的保守氨基酸序列制备的简并引物，经RT-PCR克隆Tosl7(Hirochika等，1992，Mol.Gen.Genet.，233，209-216)。Tosl7长度为4.3kb，它具有两个相同的138bp的LTR(长末端重复)和与起始甲硫氨酸tRNA的3’末端互补的PBS(引物结合位点)(Hirochika等，1996，文献同上)。通过组织培养可以强烈激活Tosl7的转录，Tosl7的拷贝数随着培养时间而增加。在用作基因组研究模型的日本晴(Japonica品种)中，其最初的拷贝数是2。在由组织培养物再生的植物中，其拷贝数增加为5至30(Hirochika等，1996，文献同上)。与在酵母和果蝇中发现的I类转座子不同的是，Tosl7经受染色体中的随机转座，并以稳定的方式诱导突变。因此，Tosl7为分析水稻基因功能的逆转录遗传学提供了有用的工具(Hirochika，1997，Plant Mol.Biol.35，231-240；K.Shimamoto Ed.，1999，Molecular Biologyof Rice，Springer-Verlag，43-58)。

发明内容
因此，本发明的目的是揭示编码能决定对盐胁迫和/或渗透压胁迫的敏感性的蛋白质的基因；操纵对多种环境胁迫，包括盐胁迫和渗透压胁迫的敏感性；选择具有不同敏感性的植物；和提供可用于产生对这些环境胁迫的耐受性增强的植物的基因。
本发明人在多株基因被破坏的水稻中发现对盐胁迫具有高水平的敏感性的突变体，所述水稻株是利用水稻逆转录转座子Tosl7的特性产生的，所述转座子通过培养被激活以经受转座。所述突变体在盐胁迫下表现出诸如生长抑制和器官形态学异常的性状。已严谨地研究了性状改变和盐胁迫之间的关系。结果发现性状改变是能够决定对盐胁迫的敏感性的基因的突变所致，从而完成了本发明。
本发明涉及编码能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有编码序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸至第243位天冬酰胺的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有编码具有一个或几个氨基酸缺失，取代和/或附加的氨基酸序列的核苷酸序列，并能控制盐胁迫耐受性的多核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，植物基因还能控制渗透压胁迫耐受性。
在本发明的一个实施方案中，多核苷酸得自水稻。
本发明还涉及编码能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有编码序列表中SEQ ID NO1的第233位A至第961位C的核苷酸序列，或可在严紧条件下与该核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
在本发明的一个实施方案中，植物基因还能控制渗透压胁迫耐受性。
在本发明的一个实施方案中，多核苷酸得自水稻。
附图简述
图1为照片(A)和(B)，(A)显示了得自再分化的日本晴株系的对盐胁迫高度敏感的突变体和作为对照的野生型幼苗的茎干和根的形态学，(B)显示了根的形态学。
图2为照片，其中显示了分别得自再分化的日本晴株系(A)和再分化的Hitomebore株系(B)的对盐胁迫高度敏感的突变体以及作为对照的野生型幼苗的茎干和根的形态学。
图3显示了决定盐胁迫敏感性的水稻基因的cDNA序列。
图4显示了由决定盐胁迫敏感性的水稻基因编码的蛋白质的推定氨基酸序列。
图5为照片，其中显示了在不含氯化钠的培养基(A)和含氯化钠的培养基(B)中发芽和生长的野生型和突变型的茎干和根的形态学，以及在正常土壤中生长的突变型的生长形态学。
图6为照片，其中显示了在含甘露糖醇的培养基中生长的野生型和突变型的茎干和根的生长形态学。
实施本发明的最佳模式本发明提供了通过使用Tosl7分离得到的，其功能已被揭示的新的植物基因。
本文所用术语“基因”指的是携有遗传信息的结构单位和决定性状的元件。可将基因定义为由大分子DNA或RNA中的某个区域的碱基序列限定的遗传功能性单位。因此，可将基因理解为最终被翻译成蛋白质的DNA或RNA，或多核苷酸。
本文所用术语“胁迫”指的是导致植物生长发生变化的外部因子。“环境胁迫”指的是外部环境变化所提供的胁迫，包括盐，高渗透压，干旱，高温，低温，强光，空气污染等。
根据本发明，提供了编码控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸。本文所用术语“盐胁迫”指的是培养介质(如土壤，允许培养植物的培养基(固体或液体)等)中的盐浓度增加到使植物生长受到不利影响的程度。盐包括导致植物中的水分吸收受抑制的任何盐，包括例如镁盐，氯盐，铝盐等。本文所用术语“盐胁迫耐受性”指的是对上述盐胁迫的耐受性。“盐胁迫敏感性”指的是对上述盐胁迫的敏感性，例如受对生长不利之因素的影响。当在具有中等/低浓度(例如50至300mM，优选为100至150mM)盐的培养介质(如土壤，允许培养植物的培养基(固体或液体)等)中培养具有“盐胁迫敏感性”的株系时，该株系会表现出生长抑制和植物器官和组织的形态学异常。“控制盐胁迫耐受性”指的是抑制或促进与盐胁迫有关，或编码决定盐胁迫耐受性的蛋白质或控制其操作的基因的表达。
本发明的植物基因还可控制渗透压胁迫耐受性。“渗透压胁迫”指的是渗透压的产生对植物生长产生不利影响。渗透压与植物细胞的生长(水分吸收)有关，所述生长中细胞吸收水分以增加细胞的体积。一般说来，当渗透压增加时，植物吸水力降低。本文所用术语“渗透压胁迫耐受性”指的是对渗透压胁迫的耐受性。“渗透压胁迫敏感性”指的是对上述渗透压胁迫的某种反应。当在导致高渗透压(例如50至600mM，优选至少为150mM甘露糖醇当量)的培养介质(例如土壤，允许培养植物的培养基(固体或液体)等)中培养具有“渗透压胁迫敏感性”的株系时，植物体(特别是根)表现出显著的生长抑制作用。“控制渗透压胁迫耐受性”指的是抑制或促进与渗透压胁迫有关，或编码决定渗透压胁迫耐受性的蛋白质或控制其操作的基因的表达。
如上所述的本发明的多核苷酸是多核苷酸，其包括具有编码序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸(Met)至第243位天冬酰胺(Asn)的氨基酸序列的核苷酸序列，或具有编码在上述氨基酸序列中缺失，取代和/或附加一个或几个氨基酸所得的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸。在一个实施方案中，本发明的多核苷酸是具有序列表中SEQ ID NO1的第233-961位核苷酸序列的多核苷酸。本发明的多核苷酸还可含有上述区域(编码SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸(Met)至第243位天冬酰胺(Asn)的氨基酸序列的核苷酸序列区域，或SEQ IDNO1的第233-961位核苷酸序列区域)之外(其5’或3’方向)的核苷酸序列(例如非-翻译区域)。更优选本发明的多核苷酸由SEQ IDNO1的第1-1154位全长序列组成。本发明的多核苷酸包括SEQ ID NO1的所有简并异构体。术语“简并异构体”指的是编码相同多肽并具有不同简并密码子的DNA。例如，对于具有SEQ ID NO1的碱基序列的DNA(其中对应于某个氨基酸(例如Asn)的密码子是AAC)而言，其中的AAC变为简并密码子AAT的DNA被称为简并异构体。
基于在基因被破坏的水稻株系中发现对盐胁迫高度敏感的突变体，使用Tosl7为标记从水稻基因组DNA中获得本发明的多核苷酸，所述水稻株系是使用水稻逆转录转座子Tosl7的特性产生的，所述转座子通过培养被激活并经受转座。因此，在一个实施方案中，本发明的多核苷酸得自水稻。
本发明可包括公开的核苷酸序列及其编码的蛋白质的片段和变体。术语“片段”欲指核苷酸序列的一部分或氨基酸序列的一部分，或由其编码的蛋白质。核苷酸序列的片段可编码至少具有天然蛋白质的一种功能性生物活性的蛋白质片段。
由本发明的多核苷酸编码的蛋白质的变体欲指通过在蛋白质的N和/或C末端缺失(截短)或附加至少一个氨基酸；在蛋白质的至少一个位点缺失或附加至少一个氨基酸；或在蛋白质的至少一个位点取代至少一个氨基酸，而由天然蛋白质修饰得到的蛋白质。例如，通过基因多态性或人工修饰可产生所述变体。
可使用多种方法(包括氨基酸取代，缺失，截短和插入)修饰由本发明的多核苷酸编码的蛋白质。这些方法通常是本领域已知的。例如，通过诱变可制备由本发明的能控制胁迫耐受性的植物基因所编码蛋白质的氨基酸序列的变体。诱变和修饰核苷酸序列的方法是本领域众所周知的，例如Kunkel(1985)Proc.Natl.Acad.Sci.USA 82488-492；Kunkel等(1987)Methods inEnzymol.154367-382；美国专利号4,873,192；Walker和Gaastra编(1983)Techniques in Molecular Biology(MacMillian Publishing Company，New York)以及其中引用的参考文献。
有关不会影响目的蛋白质的生物活性的适当氨基酸取代的指南可参见Dayhoff等.(1987)Atlas of Protein Sequence and Structure(Natl.Biomed.Res.Found.Washington，D.C.)(列入本文作为参考)的模型。优选保守取代(例如一个氨基酸被另一个具有类似特性的氨基酸所取代)。所述取代的例子包括疏水性氨基酸(Ala，Ile，Leu，Met，Phe，Pro，Trp，Tyr和Val)之间的取代；亲水性氨基酸(Arg，Asp，Asn，Cys，Glu，Gln，Gly，His，Lys，Ser和Thr)之间的取代；具有脂肪族侧链的氨基酸(Gly，Ala，Val，Leu，Ile和Pro)之间的取代；具有含羟基侧链的氨基酸(Ser，Thr和Tyr)之间的取代；具有含硫原子侧链的氨基酸(Cys和Met)之间的取代；具有含羧酸和酰胺的侧链的氨基酸(Asp，Asn，Glu和Gln)之间的取代；具有含碱基侧链的氨基酸(Arg，Lys和His)之间的取代；和具有芳香族侧链的氨基酸(His，Phe，Tyr和Trp)之间的取代。
因此，“一个或几个缺失，取代和/或附加”指的是与基因多态性或人工修饰(包括上述众所周知的方法)所导致的一样多的氨基酸取代，缺失和/或附加。“一个或几个缺失，取代和/或附加”指的是可以在蛋白质的氨基酸序列中缺失，添加和/或取代任意数目的氨基酸，只要含有所述修饰的蛋白质仍具有本发明的多核苷酸所编码蛋白质的功能即可。本领域技术人员能清楚地理解诸如氨基酸取代，缺失和/或附加的修饰对活性的影响取决于所修饰的氨基酸的位置、程度、类型等。关于本发明的多核苷酸，可在全长氨基酸序列中缺失，取代和/或附加多个氨基酸以满足下文所限定的氨基酸序列同一性，例如，只要能表达本发明的多核苷酸所编码的蛋白质的功能即可。
编码本发明的能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸包括具有编码与序列表中SEQ ID NO2的第1位Met至第243位Asn的氨基酸序列具有至少60％，优选至少65％，更优选至少70％，更优选至少75％，甚至更优选至少80％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少99％序列同一性的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，只要它能控制盐胁迫耐受性即可。
编码本发明的能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸包括具有与编码序列表中SEQ ID NO2的第1位Met至第243位Asn的氨基酸序列的核苷酸序列(优选SEQ ID NO1中第233位A至第961位C的核苷酸序列)具有至少70％，优选至少75％，更优选至少80％，甚至更优选至少85％，更优选至少90％，甚至更优选至少95％，最优选至少99％序列同一性的核苷酸序列的多核苷酸，只要它能控制盐胁迫耐受性即可。
本文所用“参照序列”指的是用作对比序列的标准序列。参照序列可以是所述序列的亚序列或全部序列；例如，全长cDNA或基因序列的片断或完整DNA或基因序列。
本文所用“比较窗”涉及到连续的多核苷酸序列和特定的多核苷酸序列区段，其中，为了对两个序列进行最佳匹配，比较窗中的多核苷酸序列相对于参照序列(不含有添加或缺失)而言，可含有添加或缺失(即缺口)。通常，比较窗的长度为至少20个连续的核苷酸，任选可以是30，40，50，100个或更长的核苷酸。本领域技术人员懂得为了避免因在多核苷酸序列中包含缺口而与参照序列有高相似性，一般可导入缺口罚分，并从匹配数目中减去缺口罚分。
进行序列匹配的比较方法是本领域众所周知的。优选通过使用BLAST(Altshul等，1997，Nucleic Acids Res.，25，3389-3402)进行同源性分析来测定参照序列(本发明的序列)和受试序列之间的总体最佳对比。在序列匹配中，参照和受试序列都是DNA序列。通过将U转变为T可以比较RNA序列。总体序列对比的结果以同一性百分比表示。序列匹配可通过程序中使用的缺省参数(default parameters)进行。
在两个核酸或多肽序列的上下文中，本文所用“序列同一性”或“同一性”涉及到在特定的比较窗中进行最一致的对比时这两个序列中相同的残基。当涉及蛋白质时使用序列同一性百分比，应认为不相同的残基位置经常是因为保守的氨基酸取代而有所不同，其中氨基酸残基被其它具有类似化学特性(例如电荷或疏水性)的氨基酸残基取代，因此不会改变分子的功能特性。当序列因保守取代而有所不同时，可将序列同一性百分比往上调以校正取代的保守特性。将因保守取代而有所不同的序列称为具有“序列相似性”或“相似性”。进行这种调节的方法是本领域技术人员众所周知的。所述方法一般包括将保守取代评分为部分错配而不是全错配，从而增加序列同一性百分比。因此，例如，当将相同的氨基酸评分计为1时，非-保守取代的评分为0，保守取代的评分在0和1之间。可以使用例如PC/GENE程序(Intelligenetics，Mountain View，California，USA)计算保守取代的评分。
本文所用“序列同一性百分比”指的是通过在比较窗内比较两个最佳比对的序列而测定的值，为了对两个序列进行最佳对比，比较窗中的多核苷酸序列部分相对于参照序列(不含有添加或缺失)而言，可含有添加或缺失(即缺口)。通过测定两个序列中出现的相同核酸碱基或氨基酸残基位置的数目以产生匹配位置数，将匹配位置数除以比较窗内的总位置数，将结果乘以100以产生序列同一性百分比，从而计算出百分比。
关于多核苷酸序列的术语“基本同一性”指的是与使用一种以标准参数描述的对比程序的参照序列相比，多核苷酸含有具有至少70％，优选至少80％，更优选至少90％和最优选至少95％序列同一性的序列。本领域技术人员会认为通过考虑到密码子的简并性，氨基酸的相似性，阅读框的定位等，可以适当调整上述数值，以测定相对应的由两个核苷酸序列编码的蛋白质的同一性。为此，氨基酸序列的基本同一性指的是序列同一性一般至少为60％，更优选至少为70％，80％，90％，最优选至少为95％。
在有关肽的上下文中，术语“基本同一性”表示在特定比较窗中与参照序列相比，所述肽含有与参照序列具有至少70％，优选80％，更优选85％，最优选至少90％或95％序列同一性的序列。任选使用Needleman等，J.Mol.Biol. 48443(1970)的同源性对比算法进行最佳匹配。例如，当两种肽仅因保守取代而有所不同时，则该肽与第二种肽基本上相同。“基本上相似的”肽共享如上所述的序列，不同之处在于不相同的残基位置处可能会因保守的氨基酸改变而有所不同。
能控制盐胁迫耐受性的本发明植物基因核苷酸序列的片段编码能控制盐胁迫耐受性之蛋白质的生物活性部分，该片段编码至少15，25，30，50，100，125，150，175，200或225个连续的氨基酸或编码本发明的全长蛋白质的全部氨基酸(如SEQ ID NO2的243个氨基酸)。一般说来，用作PCR引物杂交探针的、能控制盐胁迫耐受性的植物基因核苷酸序列的片段不编码能控制植物中的盐胁迫耐受性的蛋白质的生物活性部分。
本发明的范围还可包括编码得自非水稻之植物的能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸。例如，通过使用基于已公开的核苷酸序列的全长或部分序列而设计的引物，以选定植物的基因组DNA为模板进行PCR，接着使用所得的扩增DNA片段为探针筛选相同植物的基因组DNA或cDNA文库，即可分离出多核苷酸。在此方法中，可以使用如PCR，杂交等的方法，基于这些序列与本文所述序列的序列同一性来对其进行鉴定。本发明包括基于这些序列与本文所述序列或其片段的序列同一性而分离的序列。
在杂交技术中，将已知核苷酸序列的全长或部分序列用作探针，所述探针与得自选定生物体的一组克隆基因组DNA片段或cDNA片段(即基因组文库或cDNA文库)中存在的、其它相应的核苷酸序列选择性杂交。杂交探针可以是基因组DNA片段，cDNA片段，RNA片段，或其它寡核苷酸，并可用可检测的基团(如32P)或任何其它可测标记进行标记。因此，通过对基于本发明能控制植物的盐胁迫耐受性的植物基因的核苷酸序列的合成寡核苷酸进行标记，即可制备杂交探针。杂交以及制备构建cDNA文库和基因组文库探针的方法是本领域公知的，并公开于Sambrook等(1989)Molecular CloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York，列入本文作为参考)。
例如，可将编码本文所公开的、能控制盐胁迫耐受性之植物基因的核苷酸序列的全长或至少一个部分序列用作探针，所述探针可特异地与相应的、能控制盐胁迫耐受性的植物基因序列及其信使RNA杂交。为了在不同的条件下进行特异性杂交，所述探针对能控制盐胁迫耐受性的植物基因序列而言是独一无二的，其包括长度优选至少约为10个核苷酸，最优选至少约为20个核苷酸的序列。可在PCR中使用所述探针以扩增得自选定生物体的、能控制盐胁迫耐受性的植物基因序列。PCR扩增的方法是本领域众所周知的(PCR TechnologyPrinciples and Applications for DNA Amplification，HAErlich ed.，Freeman Press，New York，NY(1992)；PCR ProtocolsA Guide toMethods and Applications，Innis，Gelfland，Snisky，and White ed.，AcademicPress，San Diego，CA(1990)；Mattila等.(1991)Nucleic Acids Res.194967；Eckert，K.A.and Kunkel，I.A.(1991)PCR Methods and Applications 1∶17；PCR，McPherson，Quirkes，and Taylor，IRL Press，Oxford，皆列入本文作为参考)。可将此技术用作诊断试验以从所需生物体中进一步地分离出编码序列，或测定生物体中是否存在编码序列。杂交技术包括对平铺DNA文库的杂交筛选(噬斑或菌落；例如Sambrook等.(1989)Molecular CloningA LaboratoryManual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York))。
可在严紧条件下进行序列杂交。在术语“严紧条件”或“严紧杂交条件”所涉及的条件下，探针与其靶序列杂交的可测程度大于其它序列(例如至少比背景大2倍)。严紧条件依赖于序列，在不同情况下会有所不同。通过控制杂交和/或洗涤条件的严紧度，可鉴定出与探针100％互补的靶序列。或者，可调节严紧条件，使序列中出现一些错配，从而检测出较低水平的相似性。一般说来，探针的长度低于约1000个核苷酸，优选其长度低于500个核苷酸。
一般说来，严紧条件下的盐浓度低于约1.5M Na离子，一般约为0.01至1.0M Na离子浓度(或其它盐)(pH7.0至8.3)，温度对短探针(例如10至50个核苷酸)而言至少约为30℃，对长探针(例如大于50个核苷酸)而言至少约为60℃。添加去稳定剂(例如甲酰胺)也可获得严紧条件。严紧条件包括例如于37℃，用30至35％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS(十二烷基硫酸钠)为缓冲溶液进行杂交，并于50至55℃，在1×至2×SSC(20×SSC＝3.0M NaCl/0.3M柠檬酸钠)中洗涤。更严紧的条件包括例如于37℃，在40至45％甲酰胺，1.0M NaCl，1％SDS中进行杂交，并于55至60℃，在0.5×至1×SSC中洗涤。甚至更严紧的条件还包括例如于37℃，在50％甲酰胺，1M NaCl，1％SDS中进行杂交，并于60至65℃，在0.1×SSC中洗涤。
特异性一般为杂交后洗涤的函数，至关重要的因素是最终洗涤溶液的离子强度和温度。对于DNA-DNA杂交体而言，可由Meinkoth和Wahl(1984)，Anal.Biochem.，138267-284Tm＝81.5℃+16.6(log M)+0.41(％GC)-0.61(％form)-500/L的等式大致算出Tm；其中M是单价阳离子的摩尔浓度，％GC是DNA中鸟苷和胞嘧啶核苷酸的百分比，％form是杂交溶液中甲酰胺的百分比，L是杂交体的碱基对长度。Tm是50％互补靶序列与精确匹配的探针杂交时的温度(在确定的离子强度和pH下)。每当出现1％错配，Tm降低约1℃；因此，可以调节Tm，杂交和/或洗涤条件以与所需同一性的序列列杂交。例如，如果想寻找具有至少90％同一性的序列，可将Tm降低10℃。一般说来，将严紧条件选择为比确定离子强度和pH下特定序列及其互补序列的热解链温度(Tm)约低5℃。然而，高度严紧条件可利用比热解链温度(Tm)低1，2，3或4℃时的杂交和/或洗涤；中度严紧条件可利用比热解链温度(Tm)低6，7，8，9或10℃时的杂交和/或洗涤；低度严紧条件可利用比热解链温度(Tm)低11，12，13，14，15或20℃时的杂交和/或洗涤。使用上述等式，杂交和洗涤组合物和所需的Tm，本领域技术人员会懂得其中暗含杂交和/或洗涤溶液严紧度的变化。如果所需程度的错配导致Tm低于45℃(水溶液)或32℃(甲酰胺溶液)，优选增加SSC浓度，从而可以使用较高的温度。有关核酸杂交的详细指南可参见Tijssen(1993)，Laboratory Techniques inBiochemistry and Molecular Biology Hybridization with Nucleic Acid Probes，第一部分，第二章2(Elsevier，New York)；and Ausubel，等.，Eds.(1995)，Current Protocols in Molecular Biology，第二章2(Greene Publishing andWiley-Interscience，New York)。还可参见Sambrook等.(1989)MolecularCloningA Laboratory Manual(2nd ed.，Cold Spring Harbor Laboratory Press，Plainview，New York，列入本文作为参考)。
通过本领域已知的核苷酸序列分析法，或者可商购的自动测序仪，可以测定所得基因的碱基序列。
一般根据本文所述的方法获得本发明的多核苷酸，也可以基于本发明所述的序列，通过化学合成获得所述多核苷酸。例如，可根据厂商提供的说明书，使用购自Applied BioSystems，Inc.的多核苷酸合成仪(目前使用的PerkinElmer)来合成本发明的多核苷酸。
如下文实施例所述，编码本发明的植物基因的多核苷酸显然决定着对盐胁迫和渗透压胁迫的敏感性。已知植物对盐胁迫的反应与对诸如干旱，高渗透压，低温等的环境胁迫的反应部分一致(蛋白质·核酸·酶)[Protein/Nucleicacid/Enzyme](1999)Vol.44，2147-2148/2188-2198；Curr.Opinion.Plant.Biol.(2001)vol.4241-246；Curr.Opinion.Plant.Biol.(2000)vol.3217-223；TRENDS in Plant Science(2001)Vol.666-71)。本发明的多核苷酸很有可能与干旱或低温引起的胁迫有关。当本发明的多核苷酸表现出其功能时，植物一般是在胁迫条件下生长，或植物的生长不会受到不利的影响。然而，当本发明的多核苷酸因故不起作用时，植物在胁迫条件下的生长会受到抑制。
可按下文所述证实通过上述基因工程方法或化学合成方法产生的多核苷酸的所需特性，即控制盐胁迫耐受性的能力。具体地说，使用本领域众所周知的技术，将所得多核苷酸导入盐胁迫敏感型植物(例如下文实施例1中所得的ND1004(-/-)株系)。如果盐胁迫耐受性得以恢复，即可证实所需活性，即控制盐胁迫耐受性之作用的存在。通过与实施例5所述的基本上相同的方法，可以证实控制盐胁迫耐受性之作用的存在。例如，假定将多核苷酸导入ND1004(-/-)株系。如果如实施例5所述，ND1004(-/-)株系表现出与野生型植物基本上相同的盐胁迫耐受性，即可证实盐胁迫耐受性的存在。“表现出与野生型植物基本上相同的盐胁迫耐受性”指的是如实施例5所述，在盐胁迫条件下和非盐胁迫条件下，导入了本发明的多核苷酸的植物的生长没有显著差异。注意本文所用的“盐胁迫条件”指的是植物可在上述具有中等/低浓度(例如50至300mM，优选为100至150mM)盐的培养介质(如土壤，允许培养植物的培养基(固体或液体)等)中生长。
因此，可以使用本发明的多核苷酸操纵植物对上述胁迫(包括盐胁迫和渗透压胁迫)的敏感性，或选择对胁迫具有不同敏感性的植物(例如可通过使用基于具有本发明之序列的多核苷酸的全部或部分序列的探针或引物筛选多个植物株系)。
可以使用本发明的多核苷酸来产生对上述胁迫具有增强的耐受性的植物。优选这些植物可用于农业。开发胁迫耐受型植物有望减少因环境胁迫造成的农业损害，并带来有益效果，如因栽培面积扩大导致的作物产量增加，和对环境的保护作用。
可以使用本领域技术人员众所周知的方法，将天然或修饰形式的本发明的多核苷酸与适当的植物表达载体相连接，并使用已知的基因重组技术将载体导入植物细胞。基因掺入植物细胞的DNA。植物细胞的DNA包括多种细胞器(例如线粒体和叶绿体)中含有的DNA，以及染色体。
本文所用“植物表达载体”指的是在宿主植物细胞中与多种调节元件(如调节本发明基因之表达的启动子)可操作相连的核酸序列。本文所用术语“调控序列”指的是具有功能性启动子和任何相关转录元件(如增强子，CCAAT盒，TATA盒和SPI位点)的DNA序列。本文所用术语“可操作相连”表示多核苷酸与调节基因表达的调节元件(如启动子或增强子)相连接，使得基因能被表达。植物表达载体优选包括植物基因启动子，终止子，药物-抗性基因和增强子。本领域技术人员熟知可以根据宿主细胞的不同来改变所用表达载体的类型和调节元件的类型。本发明使用的植物表达载体可具有T-DNA区域。T-DNA区域可增强基因导入的效率，当使用农杆菌转化植物时，情况更是如此。
本文所用术语“植物基因启动子”指的是在植物中表达的启动子。可以使用植物启动子片段，所述片段可介导本发明的多核苷酸在再生植物的所有组织中表达。用于结构表达的启动子包括例如胭脂氨酸合酶基因的启动子(Langridge，1985，Plant Cell Rep.4，355)，用于产生花椰菜花叶病毒19S-RNA的启动子(Guilley，1982，Cell 30，763)，用于产生花椰菜花叶病毒35S-RNA的启动子(Odell，1985，Nature 313，810)，水稻肌动蛋白启动子(Zhang，1991，PlantCell 3，1155)，玉米遍在蛋白启动子(Comejo 1993，Plant Mol.Biol.23，567)，和REXψ启动子(Mitsuhara，1996，Plant Cell Physiol.37.49)。
或者，植物启动子可在特定组织中介导本发明多核苷酸的表达，或者要不然也可以处于更特异的环境或发育控制之下。本文将这种启动子称为“可诱导的”启动子。可诱导的启动子包括例如可通过环境条件，如光，低温，高温，干旱，紫外光照射，或喷洒特定的化合物外界因素来诱导的启动子。所述启动子的例子包括可用光照射诱导的、编码核酮糖-1，5-二磷酸羧化酶小亚单位的基因的启动子(Fluhr，1986，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 83，2358)，可用低温诱导的水稻lip19基因启动子(Aguan，1993，Mol.Gen.Genet.240，1)，可用高温诱导的水稻hsp72和hsp80基因启动子(Van Breusegem，1994，Planta 193，57)，可用干旱诱导的拟南芥rab16基因启动子(Nundy，1990，Proc.Natl.Acad.Sci.USA 87，1406)，和可用紫外光照射诱导的玉米醇脱氢酶基因启动子(Schulze-Lefert，1989，EMBO J.8，651)。通过喷洒植物激素脱落酸可以诱导rab16基因启动子。
“终止子”是位于基因的蛋白质编码区下游、并参与DNA转录成mRNA时的转录终止，及poly A序列的添加的序列。已知终止子有助于mRNA的稳定性，并对基因表达的量有影响。终止子的例子包括但不限于CaMV35S终止子和胭脂氨酸合酶基因的终止子(Tnos)。
“药物-抗性基因”是利于选择转化植物的基因。优选使用赋予卡那霉素抗性的新霉素磷酸转移酶II(NPTII)基因，赋予潮霉素抗性的潮霉素磷酸转移酶基因等。本发明并不局限于此。
可以使用“增强子”以增强目的基因的表达效率。优选的增强子是含有CaMV35S启动子内的上游序列的增强子区域。每有一个植物表达载体可以使用多个增强子。
可以使用本领域技术人员众所周知的基因重组技术制备上述植物表达载体。在构建植物表达载体时，除了下文实施例中所用的载体外，优选使用pBI载体或pUC载体。本发明并不局限于此。
根据导入方法等，用于导入DNA的植物材料可以适当地选自叶、茎、根、块茎、原生质体、愈伤组织、花粉、胚、茎干原基。“植物细胞”可以是任何植物细胞。“植物细胞”的例子包括植物器官中的组织的细胞，如叶和根；愈伤组织；和悬浮培养细胞。植物细胞可以是任何形式的培养细胞，培养组织，培养器官，或植物。优选植物细胞是培养细胞，培养组织或培养器官。更优选植物细胞是培养细胞。
导入DNA的植物培养细胞一般是原生质体。可通过物理化学方法，如电穿孔法和聚乙二醇法将DNA导入植物培养细胞。导入DNA的植物组织是叶、茎、根、块茎、愈伤组织、花粉、胚、茎干原基，优选为叶，茎和愈伤组织。可通过生物学方法使用病毒或农杆菌或物理化学方法如颗粒枪方法，将DNA导入植物组织。使用农杆菌的方法披露于例如Nagel等(Microbiol.Lett.，67，325(1990))。在此方法中，首先使用植物表达载体转化农杆菌(例如通过电穿孔)，然后通过众所周知的方法，如叶盘转化法将经转化的农杆菌导入植物组织。这些方法是本领域众所周知的。可以适当选择适用于被转化植物的方法。
用药物抗性，如卡那霉素抗性选择已导入植物表达载体的细胞。可通过常用的方法将选定细胞再生成植物。
通过在再分化的培养基，无激素MS培养基等中培养植物细胞，可将已导入本发明多核苷酸的植物细胞再生为植物。通过将生根不久的植物转移至土壤中，接着进行培养，可以使其生长成植物。再分化法根据植物细胞类型的不同而有所不同。多种植物的再分化法描述于水稻(Fujimura，1995，PlantTissue Culture Lett.2，74)；玉米(Shillito，1989，Bio/Technol.7，581；Gorden-Kamm，1990，Plant Cell 2，603)；马铃薯(Visser，1989，Theor.Appl.Genet.78，594)；和烟草(Nagata，1971，Planta 99，12)。
通过本领域技术人员众所周知的方法可以证实本发明的导入基因在再生植物中的表达。使用例如Northern印迹可以进行证实。具体地说，从植物叶中提取总RNA，在变性琼脂糖上对所述RNA进行电泳，并将其印迹至适当的膜上。使该印迹与经标记的RNA探针杂交，所述探针与导入基因的一部分互补，从而检测出本发明基因的mRNA。
可使用本发明的多核苷酸转化的植物包括任何可以导入基因的植物。本文所用术语“植物”涉及整个植物，植物器官(如叶、茎、根等)，种子，植物繁殖器(如花粉)，和植物细胞，以及它们的后代。本文所用植物细胞包括但不限于种子、悬浮培养物、胚、分生组织区域、愈伤组织、叶、根、茎、配子体、孢子体、花粉和小孢子。术语“植物”包括单子叶和双子叶植物。所述植物包括任何有用的植物，特别是作物植物，蔬菜植物和花卉植物。优选的植物包括但不限于水稻、玉米、高粱、大麦、小麦、黑麦、稗子、小米、天门冬属植物、马铃薯、白萝卜、大豆、豌豆、油菜籽、菠菜、番茄和矮牵牛。适用于本发明的最优选植物是水稻，尤其是Japonica水稻。
可用于本发明的制备方法的植物类型包括例如茄科、禾本科、十字花科、蔷薇科、豆科、葫芦科、唇形科、百合科、藜科和伞形科。
茄科植物的例子包括烟草属、茄属、曼陀罗属、番茄属和碧冬茄属植物。具体例子包括烟草、茄子、马铃薯、番茄、辣椒和矮牵牛。
禾本科植物的例子包括稻属、大麦属、黑麦属、甘蔗属、稗属和玉蜀黍属植物。具体例子包括水稻、大麦、黑麦、稗子、高粱和玉米。
十字花科植物的例子包括萝卜属、芸苔属、拟南芥属、辣根属和荠属植物。具体例子包括白萝卜、油菜籽、拟南芥、日本辣根和荠菜。
蔷薇科植物的例子包括李属、苹果属、梨属、草莓属和蔷薇属植物。具体例子包括梅子、桃、苹果、梨、荷兰草莓和玫瑰。
豆科植物的例子包括大豆属、豇豆属、菜豆属、豌豆属、野豌豆属、落花生属、车轴草属、紫苜蓿和苜蓿属植物。具体例子包括大豆、赤豆、菜豆、豌豆、蚕豆、花生、苜蓿和南苜蓿。
葫芦科植物的例子包括丝瓜属、葫芦和黄瓜属植物。具体例子包括葫芦、南瓜、黄瓜和甜瓜。
唇形科植物的例子包括薰衣草属、薄荷属和紫苏属植物。具体例子包括薰衣草、薄荷和紫苏。
百合科植物的例子包括葱属、百合属和郁金香属植物。具体例子包括葱、大蒜、百合和郁金香。
藜科植物的例子包括菠菜属植物。具体例子是菠菜。
伞形科植物的例子包括当归、胡萝卜、鸭儿芹和芹属植物。具体例子包括日本土当归，胡萝卜，鸭儿芹和芹菜。下文所用命名和下文所述实验室方法经常包括本领域众所周知的和常用的方法。重组方法、多核苷酸合成和细胞培养使用的是标准技术。技术和方法一般可按照本领域和多篇一般性的参考文献中的常规方法进行(一般可参见Sambrook等.Molecular CloningALaboratory Manual，2nd ed.(1989)，Cold Spring Harbor Laboratory Press，ColdSpring Harbor，N.Y.，列入本文作为参考)。
下文将通过实施例描述本发明。本发明并不局限于此。除非另有说明，实施例中所用的材料、试剂等都可以购买获得。
实施例(实施例1通过培养激活Tosl7并鉴定所得突变体)如Hirochika等，1996，Proc.Natl.Acad.Sci.USA，93，7783-7788(文献同上)所述，将“日本晴”，“Hitomebore”等(Japonica水稻品种)的成熟种子用作起始材料以进行愈伤组织起始培养和细胞悬浮培养。根据大槻的方法(1990)(水稻原生质体培养系，农林水产技术信息协会)，确定为破坏基因而激活Tosl7所用的培养条件。
简单地说，在含有2，4-二氯苯氧基乙酸(2，4-D)的MS培养基中培养成熟的水稻种子(大槻(1990)，文献同上)(25℃，1个月)，以诱导愈伤组织。在含有2，4-D的N6液体培养基中培养所得愈伤组织(大槻(1990)，文献同上)达5个月，将所述愈伤组织转移至再分化培养基(大槻(1990)，文献同上)，获得再分化的水稻(第一代(R1)植物)。
从每株植物中回收约20粒R1种子。用1.0％次氯酸钠对种子进行消毒，接着彻底清洗。将种子浸入25℃水中达24小时。然后，将种子铺在含有150mM氯化钠的MS固体培养基(描述于Murashige and Skoog，1962，Physiol.Plant.，15，473-497)上，所述培养基可提供盐胁迫条件。获得第二代(R2)植物，对其进行形态学分析。萌发后3至4周，仔细观察R2组的每个植株的表型。结果，在ND1004株系(品种日本晴)的R2组中发现一个突变体，与野生型ND1004相比，在盐胁迫条件下，该突变体的茎干和根的生长受到显著抑制(图1A最左边的幼苗除外)，根出现明显分支(图1B右边的幼苗)。另一方面，在盐胁迫条件下，野生型ND1004的生长未受显著抑制(图1A最左边的幼苗；和图1B左边的幼苗)。
因此，可以推断Tosl7转换所致的基因破坏就是盐胁迫条件下该表型表达的原因所在。
(实施例2分离Tosl7的侧翼序列)为了找到控制实施例1中所观察到的表型的基因，需分离已被转移至基因组DNA中的Tosl7侧翼序列。
通过CTAB法(Murray and Thompson，1980，Nucleic Acids Res，8，4321-4325)，由实施例1中所得的R2水稻(ND1004株系)制备DNA。使用如文献所述(Hirochika等，1996，文献同上；和Sugimoto等，1994，Plant J.，5，863-871)的总DNA，通过反向PCR扩增Tosl7靶位点序列。
简单地说，先用XbaI消化约0.5μg得自突变植物(ND1004-/-株系)的总DNA，在所述DNA中，Tosl7已通过转座插入靶位点。用酚/氯仿提取经消化的DNA，接着用乙醇沉淀以进行纯化。然后，于12℃，在300μl总体积中，使用T4 DNA连接酶连接过夜。纯化连接的DNA，将其中的1/3用作PCR模板。使用下列引物经PCR进行扩增反应Tosl7-3911F，GAGAGCATCATCGGTTACATCTTCTC和Tosl7-XbaI-R，CATGAAATAGATCCATGTATA TCT。将反向PCR产物克隆至pCR2.1-TOPO载体(Invitrogen)，接着使用测序仪(ABI，310型)进行测序。根据所得序列，设计出引物0F，GCCATCACAAATCAGCAAGC和引物3R，ATGGATTGAAGGCCAAGCCAC。使用这些引物和正常植物(未经组织培养)的总DNA进行反向PCR，以扩增出Tosl7插入的靶位点。如上所述对靶位点进行测序。
(实施例3对突变体中的引发基因进行结构分析)按照下述方法制备在土壤中生长11天的野生型水稻(日本晴)幼苗的RNA。首先，使用ISOGEN溶液提取幼苗的总RNA。将总RNA上样于mRNA纯化试剂盒(Stratagene)中包括的寡(dt)纤维素柱以获得poly(A)mRNA。通过常用方法，由所得的poly(A)mRNA合成cDNA。在HybriZAP-2.1载体(Stratagene)中构建cDNA文库。cDNA文库的感染能力为5×105个噬斑。使用大肠杆菌菌株XL1-Blue MRF2体内裂解包含cDNA插入片段的pBluescript质粒。
根据Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Sambrook等，1989)所述的方法筛选cDNA文库，其中将实施例2中获得的、Tosl7侧翼序列的反向PCR产物用作探针。
从cDNA文库中获得9个表现出强杂交信号的cDNA克隆。
使用3100型测序仪(Applied Biosystems(ABI))，在两个方向上对9个克隆中最长的，大小约为1.2kb的cDNA进行测序，接着使用开放阅读框(ORF)和BLAST(Altshul等，1997，Nucleic Acids Res.，25，3389-3402)进行同源性分析，并使用Mac Vector 6.0程序(帝人系统技术株式会社)进行分析。
根据测序分析，最长cDNA克隆的长度为1154bp(SEQ ID NO1)。使用Mac Vector 6.0程序包的mRNA分析鉴定出最长的开放阅读框为729bp，它编码由243个氨基酸组成的蛋白质(SEQ ID NO2)。由SEQ ID NO1表示的1154bp cDNA序列示于图3。开放阅读框位于cDNA序列的第233-961位。由开放阅读框编码的多肽的推定氨基酸序列(SEQ ID NO2)示于图4。
(实施例4搜索独立的突变株系)在实施例1中，选择突变株系ND1004，该株系在盐胁迫条件下表现出茎干和根的生长抑制作用。在实施例3中，分离出控制该表型的候选基因。如果相同基因内具有Tosl7插入突变的其它独立的突变株系中也能观察到相同的表型，即可得出以下结论实施例3中分离出的基因是控制上述表型的基因。为了证实这一点，按下述方法筛选独立的突变株系。
按实施例2所述，由再分化的水稻组制备DNA。使用实施例3中所得cDNA的碱基序列设计出下列四个引物，使用上述DNA为模板进行PCRGTCTGGCCAGTCGTGCAA TG；CTGCTGGCAAGAGGGCTGAT；TGGGTTCTTGGTGGCCTCAT；和GCCAAGCCACT GAAGCCATT。根据宫尾安艺雄和广近洋彦(2001)，水稻Tosl7-基因破坏法[Gene DestructionMethod Using rice Tosl7]，细胞工程学续编[Special Issue of CellularEngineering]“植物基因科学的实验计划[Protocol for Plant Genome Science]”，秀润社，73-81所述的方法，对突变体进行PCR筛选。结果，获得一种突变株系NC8328(得自日本晴品种)。
使用图3中所述的cDNA序列为问句，搜索Tosl7侧翼序列数据库(http//pc7080.abr.affrc.go.jp/～miyao/pub/Tosl7/)。结果，鉴定出另一个突变株系H0851(得自Hitomebore品种)。
当如实施例1中所述，在盐胁迫条件下培养这些株系时，在它们的茎干和根中观察到生长抑制作用和形态学异常(图2A(NC8328；最左边的植株表示野生型，中间和右边的植株表示突变型)和图2B(H0851；最左边的植株表示野生型，4株其它幼苗为突变型))。
(实施例5评价盐胁迫敏感性)在此实施例中将研究实施例2至4中获得的基因与盐胁迫敏感性之间的关系。将日本晴株系ND1004选定为具有该基因的株系，而将ND1004-/-株系用作基因已被破坏的突变体。
在ND1004株系的R2代，具有正常基因的个体和具有破坏基因的突变体被分离开来。在下述实验中，将前者称为ND1004+/+株系，而将后者称为ND1004-/-株系。进行Southern分析以测定植物是否为突变体。具体地说，从R2代ND1004株系的植物中提取DNA。用限制性酶XbaI裂解DNA，接着进行琼脂糖电泳。将DNA转印至尼龙膜上。然后，使用经32P标记的基因为探针进行杂交以证实基因的突变。将表现出突变型带模式的个体称为ND1004-/-株系。在Molecular Cloning，A Laboratory Manual(Sambrook等，1989)所述的条件下进行上述分析。
用1.0％次氯酸钠对野生型ND1004和突变型ND1004-/-的种子(每株植物约30粒种子)进行消毒，接着彻底清洗。将种子浸入25℃水中达24小时。然后，将种子铺在含有0mM和150mM氯化钠的MS固体培养基(描述于Murashige and Skoog，文献同上)上。在无菌条件下萌发种子，于25℃培养18天，其中在光照中放置14小时，在黑暗中放置10小时。图5A和B中显示了这些植物的生长。图5A显示了不含氯化钠的培养基中的野生型和突变型的茎干和根(左边)以及根(右边)(在左边的照片中，最左边的植物是野生型，其它为突变型；在右边的照片中，左边的植物为野生型，右边的植物为突变型)。B显示了含氯化钠的培养基中生长的野生型(最左边)和突变型(其它三个个体)的茎干和根。在盐胁迫条件下和非-盐胁迫条件下，野生型ND1004株系的茎干和根的形态学没有显著差异，但野生型ND1004株系的生长稍有延迟(图5A和5B)。在处于盐胁迫条件之下的突变型ND1004-/-中，在茎干和根中观察到显著的生长抑制作用，并且在根中观察到形态学异常(图5B)。而在非-胁迫条件下未观察到这种生长抑制作用和形态学异常(图5A)。
另外，当突变型萌发并生长于无盐胁迫的土壤中时(在温室中培养3个月)，它能正常生长(图5C)。
因此，通过破坏基因能表达对盐胁迫的敏感性。这表明基因决定了对盐胁迫的敏感性。
(实施例6评价对渗透压胁迫的敏感性)在此实施例中将研究实施例2至4中获得的基因与渗透压胁迫敏感性之间的关系。将日本晴株系ND1004选定为具有该基因的株系，而将ND1004-/-株系用作基因已被破坏的突变体。
用1.0％次氯酸钠对野生型ND1004和突变型ND1004-/-的种子(每株植物约30粒种子)进行消毒，接着彻底清洗。将种子浸入25℃水中达24小时。然后，在与实施例5中所述相同的条件下，在不含甘露糖醇的MS固体培养基(描述于Murashige and Skoog，文献同上)中无菌萌发并培养种子11天。切取生长11天的幼苗的茎干和根的靠上方的部分(图6中的箭头表示切下的部分)。将其余的组织切片转移至含有150mM甘露糖醇的MS固体培养基上，在与上述相同的条件下再培养7天。野生型的根重新长出并正常生长，而在突变型新长出的根中观察到显著的生长抑制作用(右边的植物表示突变型，其余两株植物表示野生型)。
因此，通过破坏基因也能表达对渗透压胁迫的敏感性。这表明该基因决定了对渗透压胁迫的敏感性。
上述实施例阐明了本发明的多个方面，以及如何产生和使用本发明的特定寡核苷酸。本发明并不局限于此。
工业实用性本发明提供了能控制环境胁迫耐受性的新的多核苷酸，它可应用于植物培育。另外，还提供了可用于操纵对环境胁迫的敏感性，选择具有不同敏感性的植物和培育出对环境胁迫耐受性更强的有用植物的多核苷酸。
序列表序列表<110>独立行政法人农业生物资源研究所(President of National Institute of Agrobiological Sciences)生物系特定产业技术研究推进机构(Chairman of the Board of Directors，Bio-oriented Technology ResearchAdvancement Institution)<120>控制对盐胁迫的耐受性的新的水稻基因<130>J1-01412279<160>10<170>PatentIn version 3.0<210>1<211>1154<212>DNA<213>稻(Oryza sativa)<220><221>CDS<222>(233)..(964)<400>1aaaatttccc ctttcctctc cacgccaaga aacgcaaaac ccccacgccg accaaggcga 60gaagcgccgc cgccgaatcg aaccgcga tcgcgcccttct cccgccgccc ccgcgcgctc 120ttctcctcct cgtcctcgac gccgctgtgc cggagtttag gcggagatcg atccggagcg 180gggtttctct tctacctggc aaggttgagg aagaaaagct tgctgatttg tg atg gct 238Met Ala1gcc cca act gca aca gct gtt ttt ctt gat gag aac ctg cat atc cat 286Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Phe Leu Asp Glu Asn Leu His Ile His5 10 15agg ggg cct gct ggc aag agg gct gat gga ttg aag gcc aag cca ctg 334Arg Gly Pro Ala Gly Lys Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ala Lys Pro Leu20 25 30aag cca tta gca gca aag caa ggg ctt caa gag aag aag gcc ctg agg 382Lys Pro Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala Leu Arg35 40 45 50gat gta tcc aac att ggc aag ccc ccg gtg tct acg cgg aag ccc ctg 430Asp Val Ser Asn Ile Gly Lys Pro Pro Val Ser Thr Arg Lys Pro Leu55 60 65cag gac gtg tcc aac acc gcc aag ccc cga ggg cgc aac att tct gat 478Gln Asp Val Ser Asn Thr Ala Lys Pro Arg Gly Arg Asn Ile Ser Asp70 75 80ggc act acc ttg aag aag act gct ctt cgc agc cat gag gcc acc aag 526Gly Thr Thr Leu Lys Lys Thr Ala Leu Arg Ser His Glu Ala Thr Lys85 90 95aac cca gtg aag aag act gta atc ttt tct gat gag acc gca aaa tgt 574Asn Pro Val Lys Lys Thr Val Ile Phe Ser Asp Glu Thr Ala Lys Cys100 105 110cat gaa tgg gct aag gat ggg gtg gag ggc acc cac ttc act ggg aat 622His Glu Trp Ala Lys Asp Gly Val Glu Gly Thr His Phe Thr Gly Asn115 120 125 130gat tct cag aag ttg gaa aag gac agt caa gac aaa cgt gtc aag aag 670Asp Ser Gln Lys Leu Glu Lys Asp Ser Gln Asp Lys Arg Val Lys Lys135 140 145aag gtg gag aaa ata atg tca gca ttg cac gac tgg cca gac gcg gta 718Lys Val Glu Lys Ile Met Ser Ala Leu His Asp Trp Pro Asp Ala Val150 155 160ttt gat cat gtg ctt ttt cca tct gag gtg gta gca gcg ttt ttt gaa 766Phe Asp His Val Leu Phe Pro Ser Glu Val Val Ala Ala Phe Phe Glu165 170 175gaa gta aaa gag atg gag ctg gaa cct gag att ctt cca gag aac aat 814Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Glu Pro Glu Ile Leu Pro Glu Asn Asn180 185 190agg cgt cgc tca agt tca ggt gat aaa atg aag ctg gct gaa gat cct 862Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Asp Lys Met Lys Leu Ala Glu Asp Pro195 200 205 210ttc acg gaa gac gag ctt gac tac tac cca ttt ctt gag aac aat ccc 910Phe Thr Glu Asp Glu Leu Asp Tyr Tyr Pro Phe Leu Glu Asn Asn Pro215 220 225gtt gag ttt cag ctg aga gat gag cta cca ctc ctg gag cct gga atg 958Val Glu Phe Gln Leu Arg Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Pro Gly Met230 235 240aac tga agaatgctaa tctgccccac ttgaaaagac ctcagaacag tgctattatc 1014Asnatcattatcc tctttgcaaa ctctacttgc tcaggagcag tttatttgta gtagtagtag 1074tagtaactag tatcctagat gttctgctgt atgtggttgg tgtgataatc attcacactt 1134taggaagaac ccaagtagcg 1154<210>2<211>243<212>PRT<213>稻(Oryza sativa)<400>2Met Ala Ala Pro Thr Ala Thr Ala Val Phe Leu Asp Glu Asn Leu His1 5 10 15Ile His Arg Gly Pro Ala Gly Lys Arg Ala Asp Gly Leu Lys Ala Lys20 25 30Pro Leu Lys Pro Leu Ala Ala Lys Gln Gly Leu Gln Glu Lys Lys Ala35 40 45Leu Arg Asp Val Ser Asn Ile Gly Lys Pro Pro Val Ser Thr Arg Lys50 55 60Pro Leu Gln Asp Val Ser Asn Thr Ala Lys Pro Arg Gly Arg Asn Ile65 70 75 80Ser Asp Gly Thr Thr Leu Lys Lys Thr Ala Leu Arg Ser His Glu Ala85 90 95Thr Lys Asn Pro Val Lys Lys Thr Val Ile Phe Ser Asp Glu Thr Ala100 105 110Lys Cys His Glu Trp Ala Lys Asp Gly Val Glu Gly Thr His Phe Thr115 120 125Gly Asn Asp Ser Gln Lys Leu Glu Lys Asp Ser Gln Asp Lys Arg Val130 135 140Lys Lys Lys Val Glu Lys Ile Met Ser Ala Leu His Asp Trp Pro Asp145 150 155 160Ala Val Phe Asp His Val Leu Phe Pro Ser Glu Val Val Ala Ala Phe165 170 175Phe Glu Glu Val Lys Glu Met Glu Leu Glu Pro Glu Ile Leu Pro Glu180 185 190Asn Asn Arg Arg Arg Ser Ser Ser Gly Asp Lys Met Lys Leu Ala Glu195 200 205Asp Pro Phe Thr Glu Asp Glu Leu Asp Tyr Tyr Pro Phe Leu Glu Asn210 215 220Asn Pro Val Glu Phe Gln Leu Arg Asp Glu Leu Pro Leu Leu Glu Pro225 230 235 240Gly Met Asn<210>3<211>26<212>DNA<213>人工序列<220><223>Tosl7-3911F引物<400>3gagagcatca tcggttacat cttctc 26<210>4<211>24<212>DNA<213>人工序列<220><223>Tosl7-xbaI-R<400>4catgaaatag atccatgtat atct 24<210>5<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物0F<400>5gccatcacaa atcagcaagc 20<210>6<211>21<212>DNA<213>人工序列<220><223>引物3R<400>6atggattgaa ggccaagcca c 21<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探测Tosl7-插入突变体的引物<400>7gtctggccag tcgtgcaatg 20<210>8<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探测Tosl7-插入突变体的引物<400>8ctgctggcaa gagggctgat 20<210>9<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探测Tosl7-插入突变体的引物<400>9tgggttcttg gtggcctcat 20<210>10<211>20<212>DNA<213>人工序列<220><223>用于探测Tosl7-插入突变体的引物<400>10gccaagccac tgaagccatt 20
权利要求
1.一种编码能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有编码序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸至第243位天冬酰胺的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有编码具有一个或几个氨基酸缺失，取代和/或附加的氨基酸序列的核苷酸序列，并能控制盐胁迫耐受性的多核苷酸。
2.根据权利要求
1的多核苷酸，其中植物基因还能控制渗透压胁迫耐受性。
3.根据权利要求
1的多核苷酸，其中多核苷酸得自水稻。
4.一种编码能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸，其中多核苷酸包括具有编码序列表中SEQ ID NO1的第233位A至第961位C的核苷酸序列，或可在严紧条件下与该核苷酸序列杂交的核苷酸序列的多核苷酸。
5.根据权利要求
4的多核苷酸，其中植物基因还能控制渗透压胁迫耐受性。
6.根据权利要求
4的多核苷酸，其中多核苷酸得自水稻。
专利摘要
本发明提供了编码能控制盐胁迫耐受性的蛋白质的基因。本发明提供了编码能控制盐胁迫耐受性的植物基因的多核苷酸。多核苷酸包括具有编码序列表中SEQ ID NO2的第1位甲硫氨酸至第243位天冬酰胺的氨基酸序列的核苷酸序列的多核苷酸，或具有编码具有一个或几个氨基酸缺失，取代和/或附加的氨基酸序列的核苷酸序列，并能控制盐胁迫耐受性的多核苷酸。
文档编号C12N15/29GKCN1464907SQ02802604
公开日2003年12月31日 申请日期2002年8月6日
发明者广近洋彦, 宫尾安艺雄, 武田真, 阿部清美 申请人:独立行政法人农业生物资源研究所, 生物系特定产业技术研究推进机构导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan