专利名称:用于同时检测线粒体dna a1555g和c1494t突变的试剂盒及其使用方法
技术领域：
本发明涉及一种用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNAA1555G 和C1494T突变的试剂盒及其使用方法。
背景技术：
线粒体DNA(Mitochondria DNA,mtDNA)突变是引起感音神经性耳聋的重要原因之一，这些突变主要位于线粒体12S rRNA和tRNA基因上。位于12SrRNA基因的同质性A1555G 和C1494T突变与氨基糖苷类抗生素(Aminoglycoside Antibiotics, AmAn)导致的非综合征型耳聋相关(Prezant TR etal.，Nat Genet, 1993,4 :259-294 ；Guan MX, Ann N Y Acad Sci，2004，1011 :259-271 ；Fischel Ghodsian, Pharmacogenomics, 2005,6 :27-36)。尽管 mtDNAA1555G或C1494T突变本身可导致耳聋，但绝大多数的A1555G或C1494T突变携带者是在使用了 AmAn(如链霉素、庆大霉素、卡那霉素、妥布霉素、小诺霉素等)后出现听力不可逆损失的。近些年虽然有许多新型强力的抗生素不断问世，但AmAn以其价格低廉、抗菌谱广、杀菌作用快等特点，仍然在临床上广泛使用(特别是用于治疗革兰氏阴性菌感染)， 其后果是由AmAn导致的耳聋病例在耳聋人群中占有较高的比例。携带这两个突变的个体对AmAn高度敏感，导致临床上常见的“一针致聋”现象，是后天获得性耳聋发生的重要原因 (Fischel-Ghodsian N, Hum Mutat, 1999,13 :261-270 ；Guan MX, Ann N Y AcadSci, 2004, 1011 :259-271 ；Van Camp G et al.，C Iin Genet, 2000, 57 :409-414.)，尤其在我国偏远农村地区，这种情况普遍存在。目前，仅浙江地区发现的mtDNAA1555G或C1494T突变的母系遗传耳聋家系已超过80个，平均发现1个突变携带者，就可对其家系内约17个未发病的母系成员实行早期干预，避免氨基糖苷类抗生素药物在这一人群中的使用，可以有效减少药物性耳聋的发生。因此，在高危人群和易感人群中开展mtDNA12S rRNA基因突变的筛查，对于预防和控制母系遗传药物性耳聋的发生有着极其重要的作用。
自1993年以来，国内外对mtDNA A1555G突变的检测除了 PCR直接测序外，普遍应用PCR-限制性片段长度多态性(PCR-RFLP)技术进行鉴定，所用的限制性内切酶为A1W6 I (BsmA I) (Fischel Ghodsian et al. , Am J Otolaryngol, 1993,14 :399-403 ；Fischel Ghodsian et al.，Am J Otolaryngol, 1997b, 18 :173-178) 自发现 mtDNA C1494T 突变与药物性耳聋的关系以来，该突变位点的检测方法主要还是序列测定(Guan MX,Ann N Y Acad Sci, 2004,1011 :259-271)。直接测序法是鉴定突变的黄金标准，但该操作繁琐，费用昂贵限制了它的广泛应用。酶切鉴定虽然方便快捷，结果可靠，但不足的Alw26 KBsmA I)酶价格较贵，与常用的限制性酶相比，价格差异达50 100倍。
近年来，国内相继报道了改良PCR-RFLP技术及荧光定量PCR技术，以满足对 mtDNAA1555G和C1494T突变进行广泛筛查的需要，如戴朴等人研发的《母系遗传耳聋线粒体基因1555位A — G突变的检测方法及其试剂盒》(公开号CN1490415)，《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因A1555G突变的探针及其用途》(公开号CN1987462)，《用于检测母系遗传线粒体耳聋基因C1494T突变的Taqman MGB探针及其用途》(公开号CN1987463)。 这些检测方法虽然在一定程度上降低了成本，但操作步骤还不够简便，不能同时检测出 mtDNAA1555G和C1494T突变；从某种程度上来说，检测费用还是偏高，这对许多家庭济困难的人来说仍是一笔不小的开支。博奥生物自主创新研发的晶芯 遗传性耳聋基因诊断芯片试剂盒是为快速、高通量筛查已知遗传性耳聋基因突变位点而专门设计的，采用了基因芯片的原理，同时检测4个耳聋相关基因(GJB2，GJB3, SLC26A4和12S rRNA)的9个突变热点。但基因芯片试剂盒检测涉及特殊仪器及大批数据处理分析对实验室设备、环境和操作人员要求较高，且费用昂贵，难以在一般医院或实验室推广使用。传统上，获得耳聋患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3 5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。因此，迫切需要一种对人体无伤害、无痛苦的获取耳聋患者基因组DNA的方法以及一种快速、 简便、准确、经济的药物性耳聋相关基因突变检测方法，以满足对mtDNA A1555G和C1494T 突变进行广泛筛查的需要。
发明内容
针对上述缺点，本发明提供一种用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNAA1555G和C1494T突变的试剂盒，该试剂盒包括
(1)提取样本基因组DNA的试剂；
(2) PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10XPCR缓冲液、MgCl2、Taq酶和三蒸水；
(3)两管引物，其中一管为引物Cl、Ni、N2和C2的混合液，另一管为引物Cl、Ml、 M2和C2的混合液；
所述两管引物是根据SEQ ID NO :7所示的人类线粒体DNA序列设计的，第一条引物序列W是反义链，为下游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸1494-1516，其序列为序列表中的SEQ ID N0:1 ；第二条引物序列Ml是反义链，为下游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸 1494-1516，其中1494位点的G置换为A，其序列为序列表中的SEQ ID NO 2 ；第三条引物序列Cl是有意义链，为上游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸1030-1052，其序列为序列表中的SEQID NO 3 ；第四条引物序列N2是有意义链，为上游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸 1533-1555，其序列为序列表中的SEQ ID NO :4 ；第五条引物序列M2是有意义链，为上游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸1533-1555，其中1555位点的A置换为G，其序列为序列表中的SEQ ID NO :5;第六条引物序列C2是反义链，为下游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸 2214-2235，其序列为序列表中的SEQ ID NO 6 ；
(4)携带A1555G突变的阳性对照模板、携带C1494T突变的阳性对照模板、以及阴性对照模板。
在上述引物中，引物m和Ml的3'末端位于线粒体DNA的1494位点，分别对应于1494位点野生型G和突变型A ；引物N2和M2的3'末端位于线粒体DNA的1555位点， 分别对应于1555位点野生型A和突变型G (参照图1)。
在上述引物中，每条引物3'端的第一位和第二位碱基间引入硫化磷酸修饰，并且引物m、Ml、N2和M2的3'端第四位碱基引入错配，即对应于线粒体的1497位的G置换为 A，1552位的G置换为A，以提高延伸反应的特异 性。[0013]在上述引物中，Nl和Cl配对用于扩增含C1494C正常位点的线粒体DNA片段，N2 和C2配对用于扩增含A1555A正常位点的线粒体DNA片段；Ml和Cl配对用于扩增含C1494T 突变位点的线粒体DNA片段，M2和C2配对用于扩增含A1555G突变位点的线粒体DNA片段； 引物Cl和C2配对用于生成一条恒定扩增带，作为PCR反应的分子内控指标。
在上述提取样本基因组DNA的试剂中，包括细胞裂解液和溶液I，所述溶液I的主要成分为蛋白酶K。在上述PCR扩增反应试剂中添加二甲基亚砜，以提高延伸反应特异性。
本发明还提供上述试剂盒的使用方法，该使用方法包括以下步骤
(1)基因组DNA的提取使用上述的提取样本基因组DNA的试剂，通过蛋白酶K消化裂解法，从被测样本中提取基因组DNA ；
(2)多重等位基因特异性 PCR 扩增(Multiplex Allele-specif ic PCR, MASPCR) 使用上述的PCR扩增反应试剂和两管引物，对样本的基因组DNA进行MASPCR扩增；本发明结合等位基因特异性PCR技术和多重PCR技术，每份DNA样本分别用两对等位基因特异性引物即引物CUNl和N2、C2以及引物CUMl和M2、C2于两个PCR反应管中进行MASPCR扩增，通过一次PCR便可在2 3小时内同时检出C1494T突变和A1555G突变。
(3)突变检测琼脂糖凝胶电泳检测，直接根据PCR扩增产生的DNA片段数量及 DNA片段大小，同时检测线粒体DNA是否发生A1555G突变和C1494T突变。
在上述的基因组DNA的提取步骤中，可从20 200 μ 1血液样本、Icm2的血滤纸片、 带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液样本中快速提取基因组DNA，根据取样方式或被测样本形式不同，对不同样本进行相应的预处理。
(1)取20 200 μ 1血液样本或Icm2的血滤纸片放入1. 5ml EP管(Eppendorf 管)，加入900 μ 1红细胞裂解缓冲液(20mmol/L Tris-HCl, pH 7. 6)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀；
(2)用70%乙醇洗带毛囊的毛发1次，后再用蒸馏水冲洗毛发2次。在1. 5ml EP 管中分别放入2 4根毛发，毛囊置于EP管底部，用干净的剪刀剪去毛发高于EP管的部分；
(3)收集唾液前，必须让被收集者漱口。以除去口腔中过多的老化细胞、食物残渣、 牙膏、咖啡、烟等物质。半小时内不要喝水、进食、吸烟，然后开始收集口腔粘膜刮片或唾液， 可视条件选择如下方法收集唾液样本①舌头围绕口腔刮取粘膜细胞，将约0. Iml唾液直接吐进EP管内；②生理盐水漱口，吐进EP管内，吸取PBS溶液至装有通过上述任一种方法收集的唾液样本的EP管中，反复吹打后，12000rpm离心5min，除去上清，重复该过程一次； ③用棉拭子反复刮拭面颊内壁6次，空气中干燥，然后用灭菌过的镊子小心撕去其外表面， 放入EP管中；④将唾液吐在滤纸上，空气中干燥后形成唾液斑，再用干净的剪刀剪成大小约Icm2碎纸片置于EP管中。
然后用细胞裂解液和蛋白酶K对上述样本进行消化裂解，再盐析法去除蛋白等杂质，异丙醇沉淀DNA，最后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后于_20°C保存备用。
用本发明所设计的4对引物，分别以相应样本的DNA为模板，通过PCR扩增后分别获得明亮清晰的大小约1206bp的恒定扩增带、对应于1555位点的70!3bp电泳条带以及对应于1494位点的487bp电泳条带。证明引物3'端引入错配碱基并进行硫代修饰并没有影响PCR的效率。[0025]当正常样本即不携带线粒体A1555G和C1494T突变的基因组DNA经两对引物Cl、 Nl和N2、C2进行MASPCR后，除了产生一条1206bp恒定扩增带外，还产生2条分别对应于 1555位点、1494位点的703bp和487bp的正常扩增带；而经两对CUMl和M2、C2引物扩增后，仅产生一条1206bp的恒定扩增带，证明该样品不含mtDNA A1555G突变和C1494T突变。 当携带mtDNAA1555G突变耳聋患者的基因组DNA经两对引物Cl、Nl和N2、C2进行MASPCR 后，出现了 1条487bp的正常扩增带及一条恒定扩增带；而经两对引物Cl、Ml和M2、C2扩增后，出现了 1条703bp的突变扩增带及一条恒定扩增带，证明了该样品携带mtDNA A1555G 突变。当携带mtDNA C1494T突变耳聋患者的基因组DNA经两对引物Cl、附和N2、C2进行 MASPCR后，出现了 1条703bp的正常扩增带及一条恒定扩增带；而经两对引物C1、M1和M2、 C2扩增后，出现了 1条487bp的突变扩增带及一条恒定扩增带，证 明了该样品携带mtDNA C1494T突变(参照图2)。
理论上，样本基因组DNA经一次PCR反应，即体系中仅加入针对突变型位点 (1494T/1555G)引物Cl、Ml和M2、C2就可进行检测，但同时我们还使用引物Cl、Nl和N2、 C2检测野生型位点(C1494/A1555)，反向验证实验结果。也就是说，同一样本基因组DNA经两次PCR，实现双向验证，从而使检测结果更为准确、可信。
本发明的试剂盒及其使用方法，具有以下特点
1.传统上获得耳聋患者基因组DNA的方法是从血液中提取，每人大约需要3 5ml。这种采血方法给很多被检者尤其是婴幼儿带来了一些痛苦和伤害，而且在跨地区传递样本时存在一定的风险和麻烦。使用本发明的试剂盒，可以从一滴血液标本、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等样本中快速提取基因组DNA。该方法不仅解决了传统上从耳聋患者血液中提取DNA的问题，减轻被检者的痛苦，而且还解决了跨地区传递样本的问题。血滤纸片、毛发以及口腔粘膜刮片(棉拭子)或唾液斑滤纸片等可以很容易的放在信封内，并可通过邮寄的方式跨地区传递。
2.本发明的试剂盒中所用的引物均经过仔细设计。首先，正常和突变等位基因间不同的碱基被设计在每一条引物的3'端，因而大大提高了扩增的特异性；另外由引物Cl 和C2配对扩增得到的产物可作为整个PCR反应的分子内控指标，从而避免假阴性结果的出现，提高检测结果的稳定性。通过调整不同引物的浓度和比例以及对PCR反应条件进行优化，以确保结果的特异性和稳定性。
3.目前国内外有几种母系遗传性耳聋基因检测方法，如直接测序法、酶切鉴定法、 荧光定量PCR检测方法、基因芯片检测方法等，由于其自身的缺陷，如费时费力、操作繁琐以及检测费用偏高而不易在临床进行推广。与这些方法相比较，本发明提供的试剂盒涉及多重等位基因特异性PCR技术，结合了等位基因特异性PCR技术及多重PCR技术两者的优点。每份DNA样本分别用两对等位基因特异性引物即引物CUl和N2、C2以及引物C1、M1 和M2、C2于两个PCR反应管中进行MASPCR扩增，通过一次PCR便可在2 3小时内同时检出C1494T突变和A1555G突变。
4.应用本发明提供的试剂盒进行mtDNAA1555G和C1494T突变检测，成本较其他检测方法更低；检测流程简便、快速，结果判读直观；对实验设备及操作人员无特殊要求，适合在一般医院、分子生物实验室开展，便于在全国范围内特别是欠发达地区实行母系遗传药物性耳聋mtDNA A1555G和C1494T突变的大规模筛查和预防性检查，有效减少氨基糖苷类抗生素敏感人群发生药物性耳聋的机会。
图1是本发明的多重等位基因特异性PCR引物示意图；
图2是本发明的多重等位基因特异性PCR扩增方案示意图；
图3是携带A1555G突变(WZD34家系)和C1494T突变(WZD102家系)的母系遗传药物性耳聋家系系谱图；
图4是多重等位基因特异性PCR扩增鉴定mtDNA A1555G和C1494T突变的2%琼脂糖凝胶电泳图。
符号说明
Cl为上游通用引物；m为正常引物序列，3'末端位于1494位，对应于1494位点野生型G，与Cl配对使用；Ml为突变引物序列，3'末端位于1494位，对应于1494位点突变型A，与Cl配对使用；C2为下游通用引物；N2为正常引物序列，3'末端位于1555位，对应于1555位点野生型A，与C2配对使用；M2为突变引物序列，3'末端位于1555位，对应于 1555位点突变型G，与C2配对使用；1494C表示线粒体DNA的1494位点为野生型C ； 1494T 表示线粒体DNA的1494位点为突变型T ； 1555A表示线粒体DNA的1555位点为野生型A ； 1555G表示线粒体DNA的1555位点为突变型G ；图中□为正常男性个体；〇为正常女性个体；■为发病男性个体；眷为发病女性个体；，为先证者；*为氨基糖苷类药物性耳聋患者； /为已死亡的个体；I为该家系的第一代成员；II为该家系的第二代成员；III为该家系的第三代成员；A表示野生型位点检测的PC R扩增(C1、N1、N2、C2)产物的电泳图；B表示突变型位点检测的PCR(Cl、Ml、M2、C2)扩增产物的电泳图；Yl为携带C1494T突变的先证者 (WZD102-III-1) ；Y2 为携带 C1494T 突变的先证者父亲(WZD102-II-1) J3 为携带 C1494T 突变的先证者母亲(WZD102-IH) J4为携带A1555G突变的先证者(WZD34_IIH) ；Y5 为携带A1555G突变的先证者父亲(WZD34-II-1) ；Y6为携带A1555G突变的先证者母亲 (WZD34-II-2) ；Y7为阴性对照模板；Y8为携带C1494T突变的阳性对照模板；Y9为携带 A1555G突变的阳性对照模板；YlO为无模板空白对照；YM为DL2000 DNA Marker。
具体实施方式
下面结合核酸序列表、附图和具体实施例对本发明作进一步说明，以使本领域的技术人员可以更好的理解本发明并能予以实施，但所举实施例不作为对本发明的限定。
实施例1
1.引物设计
使用ft~imer 5. 0软件和01igo7. 0软件协助设计改良引物，根据已公开的人类线粒体 DNA 剑桥参考序列(Human Mitochondrial DNA Revised CambridgeReference Sequence，GenBank登陆号:NC_012920. 1)或序列表中的SEQ ID NO :7进行设计，引物的设计方案如下
(1)针对mtDNA 1494位点，我们设计两条长度相同、3'末端与1494位点野生型G 和1494位点突变型A相对应的下游引物m和Ml，同时在两个等位基因特异性引物3'端第四位碱基引入错配，并在3'端的第一位和第二位碱基间引入硫化磷酸修饰，以增强特异性。由此设计出的1494位点野生型的反向引物m为mtDNA ntl494_ntl516，即5‘ -CCT TTG AAG TAT ACT TGA GAA GaG-3' (a处为硫化磷酸修饰位置)，其中1497位的G置换为 A，该序列设定为SEQ IDNO 1 ； 1494位点突变型的反向引物Ml为mtDNA ntl494_ntl516，即 5' -CCT TTGAAG TAT ACT TGA GAA GaA_3' (a处为硫化磷酸修饰位置)，其中1497位的G 置换为A，1494位点的G置换为A，该序列设定为SEQ ID NO :2。正向引物Cl为上游通用引物，与附或Ml 配对使用，是mtDNA ntl030_nt 1052，即 GGCTTT AAC ATA TCT GAA CAC AaC (a 处为硫化磷酸修饰位置)，该序列设定为SEQ ID NO :3。
(2)针对mtDNA 1555位点，我们设计两条长度相同、3'末端与1555位点野生型A 和1555位点突变型G相对应的上游引物N2和M2，同时在两个等位基因特异性引物3'端第四位碱基引入错配，并在3'端的第一位和第二位碱基间引入硫化磷酸修饰，以增强特异性。由此设计出的1555位点野生型的正向引物N2为mtDNA ntl533_ntl555，即5' -CCT ACG CAT TTA TAT AGA GAA GaA-3' (a处为硫化磷酸修饰位置)，其中其中1552位的G置换为A，该序列设定为SEQ ID NO :4 ;1555位点突变型的正向引物M2为mtDNA ntl533_ntl555， 即5' -CCT ACG CAT TTA TAT AGA GAA GaG_3' (a处为硫化磷酸修饰位置)，其中1552位的G置换为A，1555位点的A置换为G，该序列设定为SEQ ID NO :5。反向引物C2为下游通用引物，与 N2 或 M2 配对使用，是 mtDNA nt2214_nt2235，即 GGA TTT TTT AGG TAG TGG GTGaT (a处为硫化磷酸修饰位置)，该序列设定为SEQ ID NO :6。
(3)引入一条由Cl和C2配 对产生的大小为1206bp恒定扩增带，作为PCR扩增的分子内控指标。
2.用于同时检测母系遗传药物性耳聋线粒体DNA A1555G和C1494T突变的试剂盒 (100人份)包含以下组分
(1)提取样本基因组DNA的试剂包括细胞裂解液50ml X 2瓶和溶液I2ml，细胞裂解液的主要成分为 10mmol/L 的 Tris-Cl (pH8. 0) Ummol/L 的 EDTA (pH8. 0)以及 0. 1% (m/ V)的SDS ；溶液I的主要成分为20mg/ml的蛋白酶K ；
(2) PCR扩增反应试剂包括2. 5mM dNTP混合液800 μ 1、10 X PCR缓冲液lml、25mM MgCl2Iml,5U/μ 1 Taq 酶 50 μ 1、三蒸水 Iml Χ4 管；
(3)引物2管浓度均为10 μ Μ，每管150 μ 1 ；其中一管为引物Cl、Ni、Ν2和C2 混合液，另一管为引物Cl、Ml、Μ2和C2混合液，引物体积比是Cl Nl N2 C2为 1 2 2 1，Cl Ml M2 C2 为 1 2 2 1 ；
(4)携带A1555G突变的阳性对照模板、携带C1494T突变的阳性对照模板、以及阴性对照模板，阳性对照模板和阴性对照模板的浓度均为20ng/y 1，每管300μ 1。阳性对照模板是提取纯化后的携带A1555G突变或C1494T突变的基因组DNA，阴性对照模板是不携带上述突变的基因组DNA。
2.检测对象
选择1个携带A1555G突变的母系遗传药物性耳聋家系(WZD34家系)和1个携带 C1494T突变的母系遗传药物性耳聋家系(WZD102家系)。2个家系综合情况见表2，其家系图见图3。这两个家系均为母系遗传药物性耳聋家系，每个家系中均有患者使用过氨基糖苷类抗生素，特点为母系成员若使用过氨基糖苷类抗生素均发病早、耳聋程度重，若未使用过氨基糖苷类抗生素则听力正常或耳聋发病晚，程度轻。这两个家系总人数为50人，其中耳聋患者有15人。在WZD34家系中，耳聋患者受检人数为2人，听力正常者受检人数为1人； 在WZD102家系中，耳聋患者受检人数为2人，听力正常者受检人数为1人(参见表2)。
3.基因组DNA的提取
分别获取这6名受检者的血滤纸片(一滴血)，将血滤纸片用干净的剪刀剪成大小约Icm2的碎纸片放入1. 5ml EP管(Eppendorf管)，加入900 μ 1红细胞裂解缓冲液 (20mmol/L Tris_HCl，pH 7.6)室温静置lOmin，充分裂解红细胞，12000rpm离心lmin，收集白细胞沉淀；在装有白细胞沉淀的1. 5mlEP管中加入600 μ 1的细胞裂解液和3 μ 1的溶液 I，充分混勻，55°C恒温消化裂解2 池；待消化液降至室温，加入200 μ 1预冷5mol/L醋酸钾溶液，充分混勻，此时可见明显的蛋白沉淀，12000rpm-4°C离心15min ；取约700 μ 1上清加入600μ 1异丙醇于一新的1. 5mlEP管中，充分混勻，_20°C冰浴30min后，12000rpm离心 IOmin收集DNA沉淀；加入600 μ 1乙醇洗涤DNA沉淀，12000rpm离心5min，弃上清，待乙醇挥发干燥后用高压灭菌水或TE缓冲液溶解后-20°C保存备用。
4.多重等位基因特异性PCR扩增
根据上述设计的6条引物序列，通过人工合成(委托生物公司)获得4对引物，以上述提取的被检样本基因组DNA为模板，并与试剂盒中提供的阳性对照模板和阴性对照模板一起进行多重等位基因特异性PCR扩增和2%的琼脂糖凝胶电泳鉴定。每份DNA样本分别用两对等位基因特异性引物即引物CUNl和N2、C2以及引物CUMl和M2、C2于两个PCR 反应管中进行MASPCR扩增，其中引物C1、N1、N2和C2配对检测野生型位点，引物C1、M1、M2 和C2配对检测突变型位点，Cl和C2可配对产生一条恒定扩增带，作为PCR反应的分子内控指标。
表1多重等位基因特异性PCR扩增反应体系
权利要求
1.用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNAA1555G和C1494T突变的试剂盒，其特征在于，包括(1)提取样本基因组DNA的试剂；(2)PCR扩增反应试剂，包括dNTP、10 X PCR缓冲液、MgCl2, Taq酶和三蒸水；(3)两管引物，其中一管为引物Cl、Ni、N2和C2的混合液，另一管为引物Cl、Ml、M2和 C2的混合液；所述两管引物是根据SEQ ID NO :7所示的人类线粒体DNA序列设计的，第一条引物序列W是反义链，为下游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸1494-1516，其序列为序列表中的SEQ ID NO 第二条引物序列Ml是反义链，为下游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸 1494-1516，其中1494位点的G置换为A，其序列为序列表中的SEQ ID NO 2 ；第三条引物序列Cl是有意义链，为上游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸1030-1052，其序列为序列表中的SEQ ID NO :3;第四条引物序列N2是有意义链，为上游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸 1533-1555，其序列为序列表中的SEQ ID NO :4 ；第五条引物序列M2是有意义链，为上游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸1533-1555，其中1555位点的A置换为G，其序列为序列表中的SEQ ID N0:5;第六条引物序列C2是反义链，为下游通用引物，是线粒体DNA的核苷酸 2214-2235，其序列为序列表中的SEQ ID NO 6 ；(4)携带A1555G突变的阳性对照模板、携带C1494T突变的阳性对照模板、以及阴性对照模板。
2.根据权利要求
1所述的用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNA A1555G和C1494T突变的试剂盒，其特征在于，引物附和Ml的3'末端位于线粒体DNA的 1494位点，分别对应于1494位点野生型G和突变型A ；引物N2和M2的3'末端位于线粒体DNA的1555位点，分别对应于1555位点野生型A和突变型G。
3.根据权利要求
1所述的用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体 DNAA1555G和C1494T突变的试剂盒，其特征在于，每条引物3'端的第一位和第二位碱基间引入硫化磷酸修饰，并且引物N1、M1、N2、M2的3'端第四位碱基引入错配，即对应于线粒体的1497位的G置换为A，1552位的G置换为A，以提高延伸反应的特异性。
4.根据权利要求
1 3任一项所述的用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNA A1555G和C1494T突变的试剂盒，其特征在于，在所述引物中，Nl和Cl配对用于扩增含C1494C正常位点的线粒体DNA片段，N2和C2配对用于扩增含A1555A正常位点的线粒体DNA片段，Ml和Cl配对用于扩增含C1494T突变位点的线粒体DNA片段，M2和C2配对用于扩增含A1555G突变位点的线粒体DNA片段；引物Cl和C2配对用于生成一条恒定扩增带，作为PCR反应的分子内控指标。
5.根据权利要求
1所述的用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNA A1555G和C1494T突变的试剂盒，其特征在于，在所述提取样本基因组DNA的试剂中，包括细胞裂解液和溶液I，所述溶液I的主要成分为蛋白酶K。
6.根据权利要求
1所述的用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNA A1555G和C1494T突变的试剂盒，其特征在于，在所述PCR扩增反应试剂中添加用于提高延伸反应特异性的二甲基亚砜。
专利摘要
本发明提供一种用于同时检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNAA1555G和C1494T突变的试剂盒及其使用方法。所述试剂盒包括提取样本基因组DNA的试剂、PCR扩增反应试剂、引物混合液、阳性对照模板、阴性对照模板。所述试剂盒的使用方法主要包括，以血液、带毛囊的毛发、口腔粘膜刮片或唾液等为样本，采用蛋白酶K消化裂解法提取基因组DNA，然后通过多重等位基因特异性PCR同时检出A1555G和C1494T突变。本发明提供的试剂盒用于检测与母系遗传药物性耳聋相关的线粒体DNA A1555G和C1494T突变，较单独进行A1555G或C1494T突变的检测更快速、经济、简便，且对设备及环境要求低，利于推广和应用。
文档编号C12Q1/68GKCN101768637 B发布类型授权 专利申请号CN 200910223263
公开日2012年1月4日 申请日期2009年11月20日
发明者吕建新, 唐霄雯, 朱翌, 李智渊, 杨爱芬, 王金丹, 管敏鑫, 郑静 申请人:温州医学院导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (2), 非专利引用 (3),