专利名称:利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法
技术领域：
本发明涉及生物工程技术领域：
，尤其是一种利用酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法。
背景技术：
血管紧张素转化酶(ACE)对血压的调节发挥着主要的作用，伴随着对食源性降血压肽研究的不断深入，目前已经从胶原蛋白、牛乳蛋白、大豆蛋白、玉米蛋白、鱼贝类蛋白等多种食源性蛋白的酶解产物或发酵产物中获得具有降血压活性的多肽，简称降血压肽。目前对食源性多肽的体外测定主要是测定多肽对ACE酶的抑制活性。从食源性蛋白中提取具有营养性和生理活性的多肽，具有食用性安全、无副作用、效果明显等特点，提取并将这些功能多肽应用到保健品食品和强化营养食品中，不但能全面的利用食品及食品加工中优质蛋白，而且能有更有效的提高来源广泛的蛋白质原料附加值，同时也改革传统食品制造的格局，提升的食品生产和加工的科技含量。
虽然目前研究比较多，但主要是一些学术研究为主，大规模生产的降血压多肽比较少。目前研究较多的是酶解法制备降血压肽。该法最核心的就是寻找一种能高效水解蛋白，并且水解产物具有对ACE酶有较高的抑制活性的蛋白酶。酶的选择变化必然带来整个生产工艺的变化，比如，温度，酸碱环境，反应时间等。蛋白酶有很多种，如市场上有的胃蛋白酶，木瓜蛋白酶，胰蛋白酶，风味蛋白酶，中性蛋白酶，碱性蛋白酶等。这些酶对于蛋白的降解能力各不相同，而且作用位点以及产生多肽的活性也是各不相同。由于原料蛋白的复杂性，各种酶水解以后产物也是很难从理论上推断的，而且酶在不同环境下反应的结果也是截然不同。而且，制备多肽水解过程要严格控制，水解不够产率太低，水解过量就成氨基酸，产率活性都很低。
公开号为CN1896267A的专利提供了一种利用中性蛋白酶酶解蚕蛹制取降血压肽的方法，其多肽产率为3. 7%，ACE抑制活性为1. 04mg/ml ；有论文实验利用酸性蛋白酶制取降血压肽，其ACE抑制活性为1. 4mg/ml ；还有论文利用Alcalase碱性蛋白酶酶解蚕蛹制取降血压肽。这些技术描述看，首先其产率和活性与本发明技术制备的降血压肽产率和活性比较相对较低，有些技术甚至不提产率，产业化生产不经济。其次，有些技术使用的酶不经济，如Alcalase碱性蛋白酶，该蛋白酶为国外荷兰公司生产的酶，由地衣状芽孢杆菌发酵而来，价格高，而且销售渠道窄。还有，有些技术中酶的使用量太大，成本过高，没有找到一个经济的位点。
为了能工业化制备降血压肽，既要考虑降血压活性，还要考虑到产品得率，生产成本的经济性。本发明考虑到不同酶得水解特点等方面，通过实验发现，含有一定比例碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶形成的组合酶一次性酶解蚕蛹蛋白产生的酶解液能有很强的ACE抑制活性，而且产率很高。而且一次性的反应过程比普通复合酶多次酶解要节约能耗和成本。
发明内容
本发明要解决的技术问题是提供一种利用组合酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，以解决原有方法产率低、成本高的技术问题。
本发明解决其技术问题所采用的技术方案是一种利用酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，先将脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉与水按照质量比为1 7 8溶解，接着调节溶解液的PH值到7. 5 8. 5后加入组合蛋白酶进行酶解反应，该组合蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 4% 0. 7%，酶解反应温度为55°C 65°C，酶解反应时间为 180 240分钟，得到含降血压肽的水解液，再将水解液进行浓缩、冷冻干燥后得到降血压肽，组合蛋白酶为碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组合而成，其中碱性蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 3% 0. 5%，木瓜蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 05% 0. 1%，中性蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 05% 0. 1%。
为了提高酶解反应的效率，进一步地将溶解液的PH值调至7. 5 8. 5，水浴10分钟，水浴温度为90°C，然后降温至60V 65°C，再加入组合蛋白酶进行酶解反应。
为了提高产率，进一步地酶解反应结束后，迅速升温至90°C，水浴15分钟，再迅速冷却至室温以终止酶解反应，经过离心之后得到含降血压肽的水解液。
为了提高过滤效果，进一步地水解液先经过滤布离心粗滤后，再利用超滤膜进行超滤处理，得到超滤酶解液，再将超滤酶解液进行浓缩、冷冻干燥，超滤膜截留分子量为 10000道尔顿。
进一步地碱性蛋白酶的酶活力为200000U/g，国产，经2709枯草杆菌微生物通过深层发酵、提取及精制而成的一种蛋白水解酶，属于一种丝氨酸脆外高碱性蛋白酶。木瓜蛋白酶的酶活力为800000U/g，从番木瓜未熟的果实中提炼而成的。中性蛋白酶的酶活力为 200000U/g，从枯草杆菌经深层发酵培养，提取及精制而成，以上三种酶都是使用食品级的。
有益效果本发明进一步挖掘蚕蛹的利用价值，通过碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶，中性蛋白酶的组合使用一次性酶解反应，提高了多肽的产率以及ACE抑制率，并且大大降低了成本，本发明所制备的降血压肽具有很高抑制ACE活性的作用，对高血压患者具有降压的作用，且安全、无毒副作用，对血压正常者无影响，起到了很好的保健作用。
具体实施方式
实施例一
称取脱脂干蚕蛹粉(水分2 %，粗蛋白67 % ) 20kg,加入140kg水研磨成浆状，用2N 的NAOH调节pH至8. 0后，将反应体系升温至90°C，保持10分钟后，将反应温度降至60°C 后，加入碱性蛋白酶(酶活200000U/g)60g，木瓜蛋白酶(酶活800000U/g)10g，中性蛋白酶 (酶活200000U/g) 10g，保持温度和不断地搅拌进行酶解反应240分钟。反应结束后，将反应体系迅速升温至90°C并保持温度10分钟。
用大容积冷冻离心机4000r/mi η在4°C下离心15分钟，所得上清为含降血压肽酶解液。
所得酶解液先经过致密滤布离心粗滤之后，利用截留量为IOKDa的超滤膜进行超滤，得到的超滤酶解液浓缩、冷冻干燥后，得到具有降血压功能的多肽粉5. 93kg，肽含量为94. 13%，产品收率为29. 65%，以FPAGG为底物的体外实验中，测定ACE抑制活性，其IC5tl浓度为 0. 109mg/mlo
实施例二
称取新鲜完整蚕蛹(水分10%，粗蛋白47% ) 50kg，加入350kg水研磨成浆状，然后加入0. 8% -1%的ΝΑ0Η，将反应温度升至60°C后，反应2小时并保持搅拌，反应结束后， 用4000r/mi η离心机离心15分钟，所得上清液用2Ν的HCL调节ρΗ至4. 5，常温下保持30 分钟并保持搅拌，反应结束后，用4000r/min离心机离心15分钟，所得沉淀为蚕蛹蛋白。
将所得蚕蛹蛋白15Kg，加水105Kg溶解后，用2N的NAOH调节ρΗ至8.0后，将反应体系升温至90°C，保持10分钟后，将反应温度降至60°C后，加入碱性蛋白酶(酶活 200000U/g)75g，木瓜蛋白酶(酶活800000U/g) IOg,中性蛋白酶(酶活200000U/g) 10g，保持温度和不断地搅拌进行酶解反应240分钟。反应结束后，将反应体系迅速升温至90°C并保持温度10分钟。
用大容积离心机4000r/mi η在4°C下离心15分钟，所得上清为含降血压肽酶解液。
所得酶解液先经过致密滤布离心粗滤之后，利用截留量为IOKDa的超滤膜进行超滤，得到的超滤酶解液浓缩、冷冻干燥后，得到具有降血压功能的多肽粉9. 8kg，肽含量为 93. 6 %，产品收率为19. 6 %，以FPAGG为底物的体外实验中，测定ACE抑制活性，其IC5tl浓度为 0. 113mg/ml。
以上列举的仅是本发明的两个具体实施例，当然，本发明不限于以上实施例，还可以有许多变形。本领域的普通技术人员能从本发明公开的内容直接导出或联想到得所有变形，均应认为是本发明的保护范围。
权利要求
1.一种利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，先将脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉与水溶解，接着调节溶解液的PH值后加入组合蛋白酶进行酶解反应，得到含降血压肽的水解液，再将水解液进行超滤，浓缩、冷冻干燥后得到降血压肽，其特征在于所述的脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉与水的质量比为1 7 8，pH值为7. 5 8. 5，所述的组合蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0.4% 0.7%，所述的酶解反应温度为55°C 65°C， 酶解反应时间为180 240分钟，所述的组合蛋白酶为碱性蛋白酶，木瓜蛋白酶和中性蛋白酶组合而成，其中碱性蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 3% 0. 5%，木瓜蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 05% 0. 1%，中性蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0. 05% 0. 1%。
2.根据权利要求
1所述的利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，其特征在于将所述溶解液的PH值调至7. 5 8. 5，水浴10分钟，水浴温度为90°C，然后降温至60 65°C，保持10-15分钟，再一次性加入组合蛋白酶进行酶解反应。
3.根据权利要求
1或2所述的利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，其特征在于所述酶解反应结束后，迅速升温至90°C，水浴15分钟，再迅速冷却至室温以终止酶解反应，经过离心之后得到含降血压肽的水解液。
4.根据权利要求
3所述的利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，其特征在于所述水解液先经过离心滤布粗滤后，再利用超滤膜进行超滤处理，得到超滤酶解液，再将超滤酶解液进行浓缩、冷冻干燥。
5.根据权利要求
4所述的利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，其特征在于所述超滤膜截留分子量为10000道尔顿。
6.根据权利要求
1所述的利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，其特征在于所述碱性蛋白酶的酶活力为200000U/g，木瓜蛋白酶的酶活力为800000U/g，中性蛋白酶的酶活力为200000U/g。
专利摘要
本发明涉及生物工程技术领域：
，尤其是一种利用组合酶酶解蚕蛹蛋白制取降血压肽的方法，先将脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉与水按照质量比为1∶7～8溶解，接着调节溶解液的pH值到7.5～8.5后加入组合蛋白酶进行酶解反应，其中碱性蛋白酶的含量为脱脂干蚕蛹粉或蚕蛹蛋白粉的0.3％～0.5％，木瓜蛋白酶的含量为0.05％～0.1％，中性蛋白酶的含量为0.05％～0.1％，酶解反应温度为55℃～65℃，酶解反应时间为180～240分钟。本发明所制备的降血压肽具有很高抑制ACE活性的作用，对高血压患者具有降压的作用，且安全、无毒副作用，对血压正常者无影响，起到了很好的保健作用，成本低廉。
文档编号C12P21/06GKCN101701240 B发布类型授权 专利申请号CN 200910212947
公开日2012年5月23日 申请日期2009年11月12日
发明者季卫星, 袁柏强 申请人:常州康和生物技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (6), 非专利引用 (3),