专利名称:一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法
技术领域：
本发明涉及昆虫生物工程领域，更具体的说，涉及一种家蚕二化性品种的卵转基因方法。
背景技术：
家蚕，也称桑蚕，学名Bombyx mori Linnaeus，卵生，是鳞翅目模式昆虫，家蚕有一个重要的生理现象是化性，所谓化性，就是指一年中发生的世代数。家蚕有一化性、二化性、 多化无滞育性、多化有滞育性等品种差别。一化性蚕品种，一年内发生一个世代，幼虫生长期长，所结蚕茧大，但体质较弱；多化性蚕品种，一年内发生3代以上，幼虫生长期短，所结蚕茧小，茧丝质性状差，但体质较强；二化性品种一年内在自然环境中发生2代，其幼虫生长期、结茧大小介于一化与多化蚕品种之间，体质与茧丝质性状也很适合蚕业生产所需的平衡要求。因此，蚕业生产普遍使用二化滞育性卵作为种子，并形成了生产性状优良、品种丰富的二化性实用品种群体。利用二化性蚕品种作为转基因受体材料，不仅材料丰富，而且能够克服多化或一化品种生产性状上的缺点。
目前，家蚕卵期转基因显微注射方法，只有在胚胎发育早期，即产卵后25°C保护温度中注射，转基因的成功率才比较高，但是，如果二化滞育性蚕卵在胚胎发育早期转基因显微注射，由于还需要随后进行盐酸刺激等人工孵化处理蚕卵才可以催青孵化，盐酸等活化刺激物质会通过注射孔进入蚕卵，同时也由于转基因注射后蚕卵非常虚弱，经不起强烈的活化刺激，导致死亡，无法实现转基因注射操作；如果在注射后不进行盐酸等即时孵化活化刺激，通过低温等温和活化方法，由于所需时间漫长，蚕卵在保护过程也会虚弱或失水、变质死亡，同样无法实现转基因注射操作。
因此，建立一种蚕种处理方法，在转基因操作前，高效解决家蚕二化性品种滞育性卵的活化问题，使家蚕二化性实用品种卵在显微注射后不需要盐酸刺激就可以直接孵化， 将对转基因实用家蚕品种的创建发挥重要的作用。
目前已有的技术虽然一定程度解决了上述问题，但存在各自的缺陷，例如
(1)公开号为101195834(申请号200710303904. 1)的中国发明专利公布说明书公开了一种家蚕滞育种的早期浸酸转基因方法，在滞育性蚕卵产下后2. 25h-2. 5h，使用 46°C、比重1.075的盐酸，浸渍90s 210s来活化蚕卵。该技术转基因操作后蚕卵孵化率只有5%左右，转化效率不到处理卵的1%，而且孵化效果品种间差异非常大，有的品种几乎不孵化。
(2)公开号为101195833(申请号:200710303903. 7)的中国发明专利公布说明书公开了一种家蚕滞育种的低温转基因方法，在亲代卵孵化期使用15°C、相对湿度75%的环境保护，促使产出的子代蚕卵成为非滞育性卵。该技术对滞育性的影响不稳定，部分品种转基因操作后蚕卵孵化率能够达到50%左右，但孵化效果在品种间相差非常大，大部分日系二化性品种孵化率非常低，并且由于催青过程长达35d-40d，孵化的蚁蚕体质虚弱。
(3)公开号为101503704(申请号200910103397.6)的中国发明专利公布说明书公开了一种家蚕滞育种的转基因蚕的制作方法，在亲代卵孵化期使用15°C、相对湿度 75%、黑暗的环境保护；孵化后1-3龄幼虫使用23°C、相对湿度85%、黑暗的环境饲育，以及蛹期的绝对光照条件保护，促使产出的子代蚕卵成为非滞育性卵。该技术同样存在催青过程长、孵化蚁蚕体质虚弱的问题，而且在黑暗中进行饲育操作有一定困难，该技术保护下的成虫羽化无规律，给转基因操作增加了困难。
因此，发明更加简便有效的家蚕二化性实用品种转基因蚕卵孵化控制方法，对提高转基因效率，建立稳定高效的家蚕转基因技术体系，实现家蚕转基因成果的产业化有重要的现实意义，因此需要发明一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法。
发明内容
本发明目的是提供一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法。
为达到上述目的，本发明采用的技术方案是一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法，具体包括以下步骤
(1)家蚕二化性品种的亲代卵，整个催青孵化过程使用20°C、相对湿度 75%-85%、光照强度低于0. 1勒克斯(Iux)的黑暗条件保护；孵化后幼虫使用20°C-22°C、 相对湿度80% -90%,自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至3龄起蚕；3龄起蚕开始，使用25V -26°C,75% -80%相对湿度、自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至结茧；然后在 240C -260C>70% -80%相对湿度、LD = 18h:6h(每日18h光照6h黑暗)长光制条件中保护至羽化，获得产弱滞育性蚕卵的母蛾；
其中，LD表示Light/Dark，LD = 18h:6h表示每日18h连续光照后接6h持续黑暗；
(2)收集步骤(1)中羽化后的母蛾，23°C 46°C、光照强度低于IOlux弱光线条件与雄蛾交配池-他后，分开交配雌雄蛾，雌蛾投放在生产用产卵纸，25°C 46°C、光照强度低于0. Ilux的黑暗环境产卵；收集10min-15min内所产的弱滞育性卵作为人工孵化处理群体，在产卵后25°C 环境温度中0. 5h-l. 5h完成盐酸人工孵化处理；
(3)收集步骤O)中人工孵化处理群体蚕卵，经盐酸活化处理，同时将蚕卵从产卵纸脱落，获得活性化的蚕卵。
上述技术方案中，步骤(1)中所述产弱滞育性蚕卵的母蛾还可通过以下方法获得
家蚕二化性品种的亲代卵，催青前期使用22°C -2575% -85%相对湿度、自然光制条件中保护至胚胎发育阶段19期，也即戊2期胚胎；然后改用20°C、相对湿度 75% -85%、光照强度低于0. Ilux的黑暗条件保护；孵化后幼虫使用20°C _22°C、相对湿度80% -90%,自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至3龄起蚕；3龄起蚕开始，使用 25 0C -26 75% -80%相对湿度、自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至结茧；然后在 24 0C -26 70% -80%相对湿度、LD = IShJh长光制条件中保护至羽化，获得产弱滞育性蚕卵的母蛾。
上述技术方案中，步骤O)中雄蛾选自通用方法获得的普通同品种雄蛾或步骤 (1)方法与母蛾同时羽化的雄蛾。
上述技术方案中，步骤(3)中所述盐酸活化处理的条件选自以下两种的一种[0020]a、W/V为15%的盐酸，加热至40°C，浸渍蚕卵5min_8min ；
b、W/V为14%的盐酸，加热至45°C，浸渍蚕卵5min_8min。
将上述技术方案获得的改变滞育性的家蚕二化性品种的蚕卵进行常规显微注射并进行筛选，获得转基因蚕卵。
上述技术方案中，所述常规显微注射并进行筛选步骤包括以下具体步骤
(1)盐酸人工孵化处理的蚕卵，经水洗后，收集蚕卵在无菌和无核酸污染的环境进行整理，然后每卵显微注射入4000ng-5000ng的重组质粒；
(2)注射后蚕卵用无毒材料封涂注射孔，然后在无菌环境，用25°C -26 75% -80%相对湿度、自然光制条件保护蚕卵至孵化；
(3)孵化后幼虫用桑叶或人工饲料在-2775% -80%相对湿度、自然光制条件饲养，蚕蛹在-26°C,75% -80%相对湿度、自然光制条件保护至成虫羽化；
(4)羽化后蚕蛾自交或回交后，所产卵经过人工孵化处理，然后在22°C -26 75% -80%相对湿度、LD = 18h:6h长光制条件催青；在胚胎发育至22-25期，即己2-己3 阶段，筛选出有荧光标记的蚕卵，作为转基因Gl代个体。
本发明能够解决二化性蚕品种滞育性卵转基因注射后人工孵化处理对蚕卵的伤害所导致的不能孵化的问题；能够解决二化性蚕品种滞育性卵早期盐酸孵化处理后转基因注射孵化率很低的问题；能够有效克服使用多化性非滞育卵转基因材料的茧丝量低和茧丝品质差的缺点，能够提供适合二化性高产优质实用蚕品种的高效卵转基因方法。
由于上述技术方案运用，本发明与现有技术相比具有下列优点
1.由于本发明利用家蚕二化性品种亲代卵催青孵化时期的保护温度与光制组合， 以及对子代受精前蚕卵的人工孵化处理，获得适用于蚕卵转基因注射的早期高效人工活化卵，使家蚕二化性实用品种的蚕卵在进行显微注射后不再需要经过活化刺激就可以直接高效孵化。
2.该方法适合目前所有的家蚕二化性实用品种卵的转基因操作，转基因蚕卵注射后的催青孵化过程较短、孵化率高，孵化后蚁蚕体质强健。
具体实施方式
下面结合实施例对本发明作进一步描述
实施例一
使用家蚕二化性品种大造的春制滞育性卵作为亲代蚕卵，催青前期使用22. 5°C、 75% -85%相对湿度、自然光制条件中保护至19期胚胎发育阶段；然后改用20°C、相对湿度75% -85%、光照强度低于0. Ilux的黑暗条件催青保护至蚕卵孵化；孵化后幼虫在20°C -22°C、相对湿度80% -90%,自然光制条件中，使用桑叶饲养；3龄起蚕开始，在 251-261^75^-80%相对湿度、自然光制条件，使用桑叶饲养至结茧；然后在_26°C、 75% -80%相对湿度、LD = 18h:6h长光制条件中保护至羽化；收集羽化后的母蛾，24. 5°C、 IOlux以下弱光线条件与雄蛾交配证，雄蛾使用同批获得的大造品种雄蛾；分开交配雌雄蛾，雌蛾投放在生产用产卵纸，25°C、0. Ilux以下的黑暗环境产卵；收集15min内所产卵作为人工孵化处理群体；使用W/V为15%的化学纯盐酸，加热至40°C，在卵龄Ih时浸渍蚕卵5. 5min，促使蚕卵活化，同时将蚕卵从产卵纸脱落；盐酸人工孵化处理后的蚕卵，经水洗后，收集蚕卵在无菌和无核酸污染的环境进行整理，然后在卵龄ai-6h，每卵显微注射入4000ng-5000ng的红色荧光蛋白基因(ERFP)标记的piggyBac载体与辅助质粒(W/ W=I 1)，共注射蚕卵350粒；注射后蚕卵用无毒胶水封涂注射孔，然后在无菌环境，用 250C -25. 5°C,80% -85%相对湿度、自然光制条件保护蚕卵至孵化，共孵化205头，孵化率 58. 6% ；孵化后幼虫用桑叶在-2775% -80%相对湿度、自然光制条件饲养，蚕蛹在 24V -26°C,75% -80%相对湿度、自然光制条件保护至成虫羽化；羽化后蚕蛾自交后，所产 98蛾Gl代蚕卵经过人工孵化处理，然后在25°C、75% -80%相对湿度、LD = 18h:Mi长光制条件催青；在胚胎发育至22-25期，即己2-己3阶段，筛选出有荧光标记的蚕卵，作为转基因Gl代个体，转化率为31.5%。
实施例二
使用家蚕二化性品种皓月的春制滞育蚕卵作为亲代蚕卵，整个催青孵化过程使用 20°C、相对湿度75% -85%、光照强度低于0. Ilux的黑暗条件；孵化后幼虫在20°C _21°C、 相对湿度85% -90%、自然光制条件中使用桑叶饲养；3龄起蚕开始，在25. 5°C -26°C, 75% -80%相对湿度、自然光制条件中桑叶饲养至结茧；然后在25V -2675% -80%相对湿度、LD = IShih长光制条件中保护至羽化；收集羽化后的母蛾，25°C -26°C UOlux以下弱光线条件与雄蛾交配4h，雄蛾使用普通的皓月雄蛾；分开交配雌雄蛾，雌蛾投放在生产用产卵纸，25°C、0. Ilux以下黑暗环境中产卵；收集IOmin内所产卵作为人工孵化处理群体；使用W/V为15%的化学纯盐酸，加热至40°C，在卵龄1. 25h时浸渍蚕卵6. 5min，促使蚕卵活化，同时将蚕卵从产卵纸脱落；盐酸人工孵化处理的蚕卵，经水洗后，收集蚕卵在无菌和无核酸污染的环境进行整理，然后在卵龄》ι-6.釙，每卵显微注射入4000ng-5000ng的红色荧光蛋白基因(ERFP)标记的piggyBac载体与辅助质粒(W/W = 1 1)，共注射蚕卵四0 粒；注射后蚕卵用无毒胶水封涂注射孔，然后在无菌环境，用25°C -25. 5°C,80% -85%相对湿度、自然光制条件保护蚕卵至孵化，共孵化207头，孵化率71. 4% ；孵化后幼虫用人工饲料在-27°C>85% -90%相对湿度、自然光制条件饲养，蚕蛹在-26°C>75% -80% 相对湿度、自然光制条件保护至成虫羽化；羽化后蚕蛾自交后，所产卵89蛾Gl代蚕卵经过人工孵化处理，然后在22°C -2675% -80%相对湿度、LD = 18h:6h长光制条件催青；在胚胎发育至22-25期，即己2-己3阶段，筛选出有荧光标记的蚕卵，作为转基因Gl代个体， 转化率为27.8%。
实施例三
使用家蚕二化性品种75新的春制滞育性卵作为亲代蚕卵，催青前期使用 24. 5°C -25°C,75% -80%相对湿度、自然光制条件中保护至胚胎发育阶段19期；然后改用 20°C、相对湿度80% -85%、光照强度低于0. Ilux的黑暗条件保护至孵化；孵化后幼虫在 21°C _22°C、相对湿度80%、自然光制条件中，使用桑叶饲养；3龄起蚕开始，在25°C -26°C, 75% -80%相对湿度、自然光制条件，使用桑叶饲养至结茧；然后在25°C -2675% -80% 相对湿度、LD = 18: 长光制条件中保护至羽化；收集羽化后的母蛾，25°C j6°C、101ux弱光线条件与雄蛾交配证，雄蛾使用普通的75新雄蛾；分开交配雌雄蛾，雌蛾投放在生产用产卵纸，25°C、0. Ilux以下的黑暗环境产卵；收集15min内所产卵作为人工孵化处理群体； 在卵龄1. 25h，使用45°C、W/V为14%的化学纯盐酸，浸渍蚕卵5. Omin，促使蚕卵活化，同时将蚕卵从产卵纸脱落；盐酸人工孵化处理的蚕卵，经水洗后，收集蚕卵在无菌和无核酸污染的环境进行整理，在卵龄2. Oh-5.证期间，每卵显微注射入4000ng-5000ng的红色荧光蛋白基因(ERFP)标记的piggyBac载体与辅助质粒(W/W = 1 1)，共注射蚕卵300粒；注射后蚕卵用无毒胶水封涂注射孔，然后在无菌环境，用25°C -25. 5°C,80% -85%相对湿度、自然光制条件保护蚕卵至孵化，共孵化212头，孵化率70. 7% ；孵化后幼虫用桑叶在25°C -27°C、 75% -80%相对湿度、自然光制条件饲养，蚕蛹在25V -2675% -80%相对湿度、自然光制条件保护至成虫羽化；羽化后蚕蛾自交后，所产99蛾Gl代蚕卵经过人工孵化处理，然后在-25°C>75% -80%相对湿度、LD = 18h:6h长光制条件催青；在胚胎发育至22-25 期，即己2-己3阶段，筛选出有荧光标记的蚕卵，作为转基因Gl代个体，转化率为30. 5%。
权利要求
1.一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤(1)家蚕二化性品种的亲代卵，整个催青孵化过程使用20°c、相对湿度75%-85%, 光照强度低于0. 1勒克斯的黑暗条件保护；孵化后幼虫使用20°C -22 °C、相对湿度 80% -90%,自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至3龄起蚕；3龄起蚕开始，使用 25 V -26 75% -80%相对湿度、自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至结茧；然后在46°C、70%-80%相对湿度、L D = 18h Mi的长光制条件中保护至羽化，获得产弱滞育性蚕卵的母蛾；(2)收集步骤(1)中羽化后的母蛾，23n6°C、光照强度低于10勒克斯弱光线条件与雄蛾交配池-他后，分开交配雌雄蛾，雌蛾投放在生产用产卵纸，250C 、光照强度低于 0. 1勒克斯的黑暗环境产卵；收集10min-15min内所产的弱滞育性卵作为人工孵化处理群体，在产卵后25°C 环境温度中0. 5h-l. 5h完成盐酸人工孵化处理；(3)收集步骤O)中人工孵化处理群体蚕卵，经盐酸活化处理，同时将蚕卵从产卵纸脱落，获得活性化蚕卵。
2.一种家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法，其特征在于，具体包括以下步骤(1)家蚕二化性品种的亲代卵，催青前期使用22°C-25°C,75% -85%相对湿度、自然光制条件保护至胚胎发育阶段19期；然后改用20°C、相对湿度75% -85%、光照强度低于 0. 1勒克斯的黑暗条件保护；孵化后幼虫使用20°c -22°c、相对湿度80% -90%,自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至3龄起蚕；3龄起蚕开始，使用25°C -2675% -80%相对湿度、自然光制条件中桑叶或人工饲料饲养至结茧；然后在-26°C,70% -80%相对湿度、 L D = 18h 他长光制条件中保护至羽化，获得产弱滞育性蚕卵的母蛾；(2)收集步骤(1)中羽化后的母蛾，23n6°C、光照强度低于10勒克斯弱光线条件与雄蛾交配池-他后，分开交配雌雄蛾，雌蛾投放在生产用产卵纸，250C 、光照强度低于 0. 1勒克斯的黑暗环境产卵；收集10min-15min内所产的弱滞育性卵作为人工孵化处理群体，在产卵后25°C 环境温度中0. 5h-l. 5h完成盐酸人工孵化处理；(3)收集步骤O)中人工孵化处理群体蚕卵，经盐酸活化处理，同时将蚕卵从产卵纸脱落，获得活性化蚕卵。
3.根据权利要求
1或2所述家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法，其特征在于， 步骤O)中雄蛾选自通用方法获得的普通同品种雄蛾或步骤(1)方法与母蛾同时羽化的雄蛾。
4.根据权利要求
1或2所述家蚕二化性品种卵转基因用蚕卵的制备方法，其特征在于， 步骤(3)中所述盐酸活化处理的条件选自以下两种的一种a、W/V为15%的盐酸，加热至40°C，浸渍蚕卵5min_8min；b、W/V为14%的盐酸，加热至45°C，浸渍蚕卵5min-8min。
专利摘要
本发明涉及昆虫生物工程领域，更具体的说，涉及一种家蚕二化性品种的卵转基因方法，利用亲代蚕卵催青孵化时期的保护温度与光制组合，以及对子代受精前蚕卵的人工孵化处理，获得早期活化卵，然后进行常规显微注射并进行筛选，获得转基因蚕卵的方法。使用本发明方法，能够解决二化性蚕品种滞育性卵转基因注射后人工孵化处理对蚕卵的伤害所导致的不能孵化的问题；能够解决二化性蚕品种滞育性卵早期盐酸孵化处理后转基因注射孵化率很低的问题；也解决了二化性蚕品种滞育性卵受精后盐酸孵化处理、以及利用亲代蚕卵低温与黑暗孵化条件获得的二化性品种子代非滞育卵的胚胎强健性差和幼虫成活率低的问题。
文档编号C12N15/85GKCN101703035 B发布类型授权 专利申请号CN 200910212990
公开日2011年11月30日 申请日期2009年11月9日
发明者司马杨虎, 徐世清, 牛艳山, 甘丽萍, 袁红霞 申请人:苏州大学导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan专利引用 (4),