专利名称:由培养液分离动物细胞的过程的制作方法
本发明是关于由动物细胞培养液中分离出动物细胞和/或动物细胞碎片的过程，这过程最适合用于由培养液分离出杂种瘤。
分子生物学近年来的发展，导致了精细发酵方法和仪器的需求的增加，特别是人们对应用多种技术处理的动物细胞进行大量培养以便由这些细胞生产出多肽提取物和蛋白质，这过程的一个步骤，是要把动物细胞和/或动物细胞碎片，从培养液分离出来，这是从培养液分离出细胞产物的首要步骤。
传统的分离方法，是把动物细胞用离心分离方法，从培养液分离出来。这方法通常效率低，因为要保证完全分离的话，就需要相对长的时间来获得相当大加速度。另外一个办法，就是过滤出培养液，但是这个做法，很容易使过滤器被动物细胞和细胞的残片堵塞。所有两种办法，都可能丢除及带走动物细胞及有用的细胞产物，并且没法把细胞碎片和培养液上清液完全分离。
本发明的目的，提高由培养基分离动物细胞能力。
已经知道的，絮凝微生物培养液，有助于由培养液分离微生物细胞;这种方法例子是把澄清剂加进不透明的爱尔啤酒内，澄清剂会使酵母菌和酵母菌碎片絮凝，最后沉淀在酿酒器的底部。
在一般情况下，动物细胞物质的表面，都带有净负电荷。由于静电引力，不同极性的颗粒串接形成絮凝。我们可以相信，带有正电荷的物质，会絮凝动物细胞和动物细胞碎片。很奇怪，我们发觉带负电的溶化了的聚合物，对絮凝动物细胞和动物细胞碎片，竟然很有功效。此外，我们试验了多种带负电溶解的聚合物，只有一种显示出有絮凝的极满意效果，我们假定，这是由于聚合物表面上的电荷分布和细胞上的带正电荷区域相互匹配所造成的。
按照本发明，我们提出一种把动物细胞和/或动物细胞碎片，从动物细胞培养液分离出来的方法必包括在培养液内混入多聚半乳糖醛酸，使动物细胞和/或动物细胞碎片絮凝，再从培养液分离出絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片。
使用多聚半乳糖醛酸作絮凝剂，有多种好处。这些在物理分离前的动物细胞和/或动物细胞碎片的絮凝，可以显著地增加产品产量，培养基的纯度，及加快整体分离过程的速度。动物细胞碎片，由于它们的体积细小，很多时候都很难除去，但是使用本发明的话，就不但能够絮凝动物细胞，还能够絮凝动物细胞碎片。此外，使用本发明的工艺，只有少量的动物细胞由培养液的上清液中带走。多聚半乳糖醛酸本身不含毒素，供应方便，价钱也便宜，它是由果胶脱酰得到的。
这多聚半乳糖醛酸可以是多聚半乳糖醛酸本身，或是任何能够使动物细胞或动物细胞碎片絮凝的多聚半乳糖醛酸衍生物。如果多聚半乳糖醛酸是基本上溶于动物细胞培养液，它的分子量可以在一宽的范围内变化。同样地，多聚半乳糖醛酸的浓度通常也可以大范围变化，而事实上因为这有效浓度是受到细胞密度的影响，所以多聚半乳糖醛酸的浓度是没法準确划定范围。不过，可行的浓度上限由使细胞培养液变为凝胶的多聚半乳糖醛酸浓度决定。这一点显然是不理想。浓度的下限是由动物细胞或动物细胞碎片基本上开始絮凝的浓度来确定的。在一般的培养液内，多聚半乳糖醛酸浓度至少可以是0.004%(重量/体积)，最好是大约0.03%。
动物细胞和/或动物细胞碎片随重力沉淀后，可以使用过滤法或离心分离法，从液体分离絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片。所获得清澈上清液，再可进行纯化，得到由动物细胞所产生的多肽或蛋质。上述的过程，当然可以用于那些例如声波振动破坏了的细胞(在细胞培养液内)。
动物细胞，也许是在活体外生长的天然存在的动物细胞，不过，最好是一些遗传变异了的动物细胞，理想的动物细胞，有杂种瘤细胞，例如是从家鼠或田鼠衍生的杂化种细胞，此外，这些动物细胞也可以是人的成淋巴瘤细胞，动物细胞产生抗体(IgM或IgG)的情况，在动物细胞和/或动物细胞碎片絮凝的过程中，只有少量抗体由培养基液中排出，因此大量抗体得保留下来。
絮凝时，理想培养液至少调整至酸性的PH值，因为酸性的PH值可确保细胞表面的氨基团和组氨酸残馀物的质子化作用，由此增加了细胞上正电荷区域。低于PH3时，聚合物被电离;较好的PH值是PH4和PH7之间，PH值最好是在PH5和PH6之间。
培养液可以是任何合适培养基，例如是Dulbecco Modified Eagle Medium(DMEM)或L-Broth。
用举例方法来说明本发明。
例一
实验实施将用来证明，是在培养液中产生抗体IgM的杂种瘤细胞的培养基上，大量带负电可溶性聚合物的絮凝能力。这实验的结果，着重说明多聚半乳糖醛酸在这方面的非凡特性。
含有5%少牛胎血清和Dulbecco Modifhed EagleMedium培养基内，使用一般滚筒培养技术，培养出产生IgM的杂种瘤细胞(NBI-一种家鼠杂种瘤)。细胞繁殖通常在对数生长的阶段的末期，这时候细胞的密度和细胞残馀物的数量是最大。制备下列的带负电聚合物水溶液多聚半乳糖醛酸(4%重量/体积)、分子量8000的葡聚糖硫酸酯(10%重量/体积)、分子量500，000的葡聚糖硫酸酯(8%重量/体积)、藻酸、Carageenan(一种海藻糖)、DEAE-葡聚糖、聚谷氨酸、聚硫酸乙烯酯。
使用IMHU或固态三HU碱，把培养基(50ml)的PH，分别拉到在5.0、7.0及9.0。在15ml刻度试管内，加入10ml每种PH值样品，再加进要试验的絮凝剂，重覆倒转试管来混合液体。把全部试管直立放置，及分别在2小时后18小时后来观察。用离心法澄清一组PH值为5.0含多聚半乳糖醛酸试管。澄清的上清液抽样，然后使用ELISA验定法测量IgM的浓度。
实验结果列于表一。
藻酸、Carageenan(一种海藻糖)、葡聚糖凝酯(D·E·A·E·)-葡聚糖、聚谷氨酸、与及聚硫酸乙烯酯等，都是无法在1%(重量/体积)浓度产生絮凝。一在0.04%(重量/体积)和0.0004%(重量/体积)之间浓度的多聚半乳糖醛酸絮凝的培养基产生上清液中没检测出IgM。
例二
例一描述的实验，展示了多聚半乳糖醛酸，在培养液内絮凝杂种瘤细胞的能力。这部分试验已扩大到实验工厂的水平。
用下列的方法，繁殖及得到30升的培养基。把CO2吹入培养发酵器内，使培养液的PH下降到5.0至6.0之间。视杂种瘤细胞和细胞碎片的密度，多聚半乳糖醛酸加进0.04%至0.1%间浓度培养液中，再加入大约50毫升体积的絮凝剂。把它们在发酵器内混合，之后，停止CO2气体的供应，让絮凝过程进行。需1个小时让絮凝了的细胞和细胞碎片沉淀。跟着，把絮凝了的细胞和细胞碎片，用卷曲的聚丙烯深过滤片(标称0.1微米小孔直径)来过滤，或使用Westfalia SA-I分离器进的连续地离心分离。使用这两种方法获得的上清液，比使用传统分离技术获得的上清液更清。这种更大范围试验用100升及1000升的培养基反覆进行成功。另外，已表明用5M H2SO4也可降低PH值，并且在加入前多聚半乳糖醛酸溶解水中形成的浓度(重量/体积)为20%以利进行试验。
例三
用100升培养基量的家鼠杂种瘤细胞系和人的淋巴瘤细胞系(EB变异的淋巴细胞)，重覆例二所描述的实验。在这两种情况中都能够成功成功地絮凝和分离动物细胞和动物细胞碎片。
当然，大家应该知道，这里所描述的内容及例子，纯粹是举例性质，细节可以变化，而仍然不脱离本发明的范围及原则。
权利要求
1、由动物细胞培养液内，分离出动物细胞和/或动物细胞碎片的过程，特征是其包括用多聚半乳糖醛酸来絮凝细胞，及把这些絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片，从培养液分离出来。
2、根据权利要求
1的过程，特征是那些絮凝了的动物细胞和/动物细胞碎片，是用过滤法或离心法从培养液分离出来。
3、根据权利要求
1及2的过程，特征是这里的动物细胞是遗传变异了的动物细胞。
4、根据权利要求
3的过程，特征是动物细胞是杂种瘤细胞。
5、根据权利要求
3的过程，特征是动物细胞是成淋巴瘤细胞。
6、根据上述任何一个权利要求
的过程，特征是培养液的PH值，至少在絮凝期间，控制在酸性的PH值。
专利摘要
由动物细胞培养液内，分离出动物细胞和/或动物细胞碎片的过程，包括用多聚半乳糖醛酸来絮凝细胞、及把这些絮凝了的动物细胞和/或动物细胞碎片，从培养液分离出来。
文档编号C12N5/06GK85103552SQ85103552
公开日1986年10月29日 申请日期1985年5月4日
发明者肯尼 申请人:细胞技术有限公司导出引文BiBTeX, EndNote, RefMan