>[0047] 以栽培大豆（Glycine max(L. )Merr. ) Williams82为材料，采用CTAB法提取大豆 根系基因组DNA。根据大豆基因组数据库查找TIP基因及其上游序列，设计特异引物上游引 物Fl和下游引物R1，以提取的总DNA为模板，进行PCR扩增。
[0048] Fl :5' -TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（序列 1 的第 1-20 位）；
[0049] Rl :5' -CAACACCAGCGAACACGAAA-3'（序列 1 的第 2145-2163 位的反向互补序列），
[0050] 反应程序：94°C 5min ;94°C 30s，55°C 30s，72°C 2min30s，35 个循环；72°C 延伸 IOmin0
[0051] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0052] 结果见图1，其中，泳道M为DL2000plus的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。 用回收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T-Simple载体（TaKaRa，目录 号：D103A)连接，连接产物转化E. coli感受态细胞DH5a (TIANGEN，目录号：CB101)，提取 质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果表明，PCR产物为2163bp，如序列 1所示，其中包括l〇9bp TIP基因⑶S序列(序列1的第2055-2163位)。
[0053] 为了得到不含TIP基因 CDS序列的启动子片段，从翻译起始密码子ATG开始，新设 计了 一条下游引物R2进行第二轮PCR扩增，以第一轮PCR产物(序列I)为模板，以Fl和R2 为引物进行第二轮PCR扩增。
[0054] Fl :5' -TCAGGAGGACGAATAGCCCA-3'（序列 2 的第 1-20 位）；
[0055] R2 :5' -TTTGGCACCTCACCTCAC-3'（序列 2 的第 2037-2054 位的反向互补序列）。
[0056] 反应程序：94°C 5min ;94°C 30s，52°C 30s，72°C 2minl5s，35 个循环；72°C 延伸 IOmin0
[0057] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0058] 结果见图2,其中，泳道M为DL2000的DNA分子量标准，泳道1为PCR产物。用回 收试剂盒纯化回收PCR产物，PCR产物回收后与pMD18-T-Simple载体连接，连接产物转化 E. coli感受态细胞DH5 α，提取质粒，经PCR扩增为阳性的重组质粒送去测序。测序结果得 到了 2054bp的GmTIPp全长启动子序列，如序列2所示，命名为GmTIPp-2054。将测序正确 的重组质粒命名为pMD18-GmTIPp。
[0059] 实施例2、含有GmTIPp-2054启动子的重组表达载体的构建
[0060] 一、带有酶切位点的大豆GmTIPp-2054启动子序列的获得
[0061] 由于pMD18-T_Simple载体不带有酶切位点，根据GmTIPp-2054序列(序列2)，分别 设计了 1条带Kpn I酶切位点的上游引物F-2054和1条带Pst I酶切位点的下游引物R， 以实施例1获得的重组质粒pMD18-GmTIPp为模板，分别进行PCR扩增。
[0062] 引物序列如下：
[0063] F-2054 :5' -GGTACCTCAGGAGGACGAATAGCCCA-3,(下划线后的序列为序列 2 的第 1-20 位）；
[0064] R :5' -CTGCAGTTTGGCACCTCACCTCAC-3' (下划线后的序列为序列 2 的第 2037-2054 位的反向互补序列）。
[0065] 采用引物对F-2054/R扩增进行PCR扩增的反应程序：94 °C 5min ;94 °C 30s， 54°C 30s，72°C 2minl5s，35 个循环；72°C延伸 lOmin。
[0066] 反应结束后，用1%琼脂糖凝胶电泳检测PCR扩增产物。
[0067] 结果如图3所示。将所得PCR产物分别进行测序，结果显示：引物对F-2054/R扩 增所得PCR产物的序列为"GGTACC+序列2的第1-2054位+CTGCAG"。
[0068] 进一步，将以上PCR产物与pMD 18-T-S imp I e载体连接，所得重组质粒命名为 pMD18-GmTIPp-2054。
[0069] 二、重组表达载体的构建
[0070] 将步骤一获得pMD18-GmTIPp-2054进行Kpn I和Pst I的双酶切，回收酶切产物， 将所得回收片段分别与经过同样双酶切的PC13P1载体(质粒图谱如图5所示）的骨架大片 段相连(酶切图谱如图4所示)，获得重组质粒。将经酶切鉴定正确的质粒送样测序。将经测 序表明在PC13P1载体的多克隆位点Kpn I和Pst I之间插入序列表中序列2的第1-2054 位核苷酸的重组质粒命名为pCAM-TIPp-2054。
[0071] 在重组表达载体pCAM-TIPp-2054中，GmTIPp-2054启动子位于⑶S基因上游，驱 动GUS基因的转录，同时在GUS基因下游均连接有终止其转录的NOS终止子。
[0072] 实施例3、转GmTIPp-2054拟南芥的获得及表达特性研究
[0073] 一、浸花法转化拟南芥及鉴定
[0074] YEP液体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：5g/L NaCl，5g/L酵母提取物， l〇g/L胰蛋白胨；pH7. 0。各浓度为相应组分在培养基中的终浓度。
[0075] 1/2MS固体培养基：溶剂为水，溶质及其浓度如下：2. 17g/L MS盐（Phyto Tech，目 录号：M524)、7g/L琼脂、30g/L蔗糖，lml/L MS有机（Phyto Tech,目录号：Μ533)，ρΗ5·8。各 浓度为相应组分在培养基中的终浓度。
[0076] 1、用实施例2获得的重组质粒pCAM-TIPp-2054,以及pC13Pl空载体分别转化根癌 农杆菌GV3101感受态细胞，得到2种重组农杆菌。将2种重组农杆菌分别接种于YEP液体 培养基(含卡那霉素 50mg/L)，28°C、220rmp振荡培养，得到0D600=0. 4-0. 6的2种重组农杆 菌菌液。
[0077] 2、将pC13 (Delta)⑶S载体(质粒图谱如图6所示）转化根癌农杆菌GV3101感 受态细胞，得到重组农杆菌。将重组农杆菌接种于YEP液体培养基(含卡那霉素 50mg/L)， 28°C、220rmp振荡培养，得到0D600=0. 4-0. 6的重组农杆菌菌液。
[0078] 3、将步骤1得到的2种重组农杆菌菌液分别与步骤2中的重组农杆菌菌液按体积 比1:1混合，加入0. 5% (v/v) silwet L-77,共得到2种农杆菌混合液，用来浸染植株。
[0079] 4、浸染植株的准备：将拟南芥（Arabidopsis thaliana(L. )Heynh. ) Columbia 的 种子在10%(v/v)次氯酸钠的水溶液中消毒15min，用无菌水洗3-4次后，将种子种于1/2MS 固体培养基上，4°C培养3d后，置于22°C培养箱中培养，光照16h/黑暗8h。生长2周的植 株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，生长到开花期的拟南芥用来浸染。
[0080] 5、浸染：将上述步骤4中生长到花期的拟南芥植株在步骤3中制备好的2种农杆 菌混合液中浸泡lmin，浸染后的植株遮光过夜，浸染第二天后，恢复正常培养，一周后采用 同样方法对植株进行第二次浸染。直至收获T 1代种子。
[0081] 6、将收获的T1代种子消毒后，种植于含50mg/L潮霉素的1/2MS培养基上，4°C培养 3d后，置于22°C培养箱中培养，光照16h/黑暗8h，筛选出能够正常生长的植株，将生长2周 的植株从培养基中移栽到土壤基质中继续生长，收获T 2代种子。同时提取T1代植株的基因 组DNA，进行PCR检测。具体如下：以基因组DNA为模板，采用引物对F-2054/R进行PCR检 测，得到大小约为2054bp目的条带(序列2)的拟南芥为转入pCAM-TIPp-2054的阳性植株。 同时设置以未转基因的野生型植株基因组DNA代替模板的阴性对照，以及以对应质粒代替 模板的阳性对照。PCR检测结果如图7所示。
[0082] 7、检测出目的条带的株系，其T2代种子采用步骤6中同样的方法种植培养，收获 T3种子，选择T3代不再分离的纯合株系的种子用来后续的试验。
[0083] 二、转GmTIPp-2054拟南芥表达特性的研究
[0084] 1、营养