的优良单株，取得同意后采果留种，经多代自交提纯留种而成。恢复系139D-21-3在本专利申请日前公众可以从浙江省农业科学院购买获得，浙江省农业科学院已于2014年10月起向公众发放该生物材料,主要特征为:早熟,座果能力极强，叶色深绿；高抗病毒病,耐高低温能力强；果实纵径约18cm，横径约1.5cm，单果重约1g ;果形为细羊角型，果条笔直美观，果表色泽鲜亮，绿熟果深绿色，老熟果火红色；经鉴定基因型为(N) MsMs。
[0018]辣椒不育系材料131BC5A: 2009年从浙江省杭州博邦种子有限公司引进的三系配套杂交一代品种‘艳阳’的分离后代中获得的不育株，经大量测交选出优良不育系131，经5代回交而成。不育系材料131BC5A为自育材料在本专利申请日前公众可以从浙江省农业科学院购买获得，浙江省农业科学院已于2014年10月起向公众发放该生物材料，主要特征为:生长势强，叶色深绿，高抗病毒病；花药萎缩不开裂或微裂，无花粉，不育性状稳定，经鉴定基因型为(S) msms。
[0019]②杂交方法:
以不育系131BC5A为为母本，恢复系139D-21-3为父本，获得？1杂交组合131BC5A x139D-21-3, Fl 自交获得 131BC5A x 139D-21-3 F2分离群体。
[0020]本发明按以下步骤进行:
1、SSR分子标记的引物设计:在网站数据库SGN (http://sgn.Cornell, edu/)和ThePepper Genome Database (http://peppersequence.genomics.cn)中找分布于辣椒 6 号染色体上的SSR标记,并进行筛选。SSR标记主要是利用SSRHunter软件及gramene网站上 SSRtool (http://archive.gramene.0rg/db/markers/ssrtool)寻找重复序列，并用Primer5软件设计引物。
[0021]2、辣椒基因组DNA的提取:取辣椒131BC5AU39D-21-3亲本和F1J2代各单株样品苗期幼嫩叶片0.02-0.05g克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；
3、基因组DNA的PCR扩增:在各PCR管中分别加入步骤(2)提取的各辣椒样品基因组DNA IyL后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，步骤(I)设计的上下游引物各0.25 μ L，加无菌纯水至10 μ L，PCR反应程序:94°C 3 min预变性后，接着94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35个扩增循环，最后72°C延伸5 min，产物4°C保存；
4、PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:各样品分别取扩增产物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚兰、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液
2.5yL，混匀；将混合物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳；最后银染显色，进行观察，用数码相机拍照保存；共显性标记统计方法，与母本131BC5A —致的带型记为b，与父本139D-21-3 —致的带型记为a，杂合的带型记为h ；
5、筛选出与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记P印43和P印20:pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，P印20标记的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示；
6、辣椒样品恢复基因的检测:按步骤(4)所述的标记统计方法来确定辣椒样品是否具有恢复基因(见图1)。
[0022]实施例2、(用本发明的标记引物对辣椒雄性不育恢复基因进行检测)
本例所述辣椒材料:辣椒不育系对照材料:131BC5A，编号为I ;恢复系对照材料:139D-21-3，编号为2 ;自选辣椒恢复材料:编号为5、6和7 ;自选辣椒不育材料:编号为3、4、8和9 ;
检测方法按以下步骤进行:
1、辣椒基因组DNA的提取:取待检测辣椒样品苗期幼嫩叶片各0.02-0.05克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；
2、基因组DNA的PCR扩增:在各PCR管中分别加入步骤(I)提取的各辣椒样品基因组DNA IyL后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，ρ印43或ρ印20上下游引物各0.25 μ L，加无菌纯水至10 μ L ;扩增条件、程序同实施例1 ;
3、PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:各样品分别取扩增产物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚兰、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5μ L，混匀；将混合物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，具体分析同实施例1 ;
4、辣椒样品恢复基因的检测:标记统计方法同实施例1(见图2)。
[0023]实施例3、(用本发明试剂盒对不同辣椒材料恢复基因的检测)
本例所述辣椒材料:辣椒不育系对照材料:131BC5A，编号为I ;恢复系对照材料:139D-21-3，编号为2 ;自选辣椒恢复材料:编号为3、5、8、9和11 ;自选辣椒不育材料:编号为4、6和7 ;保持系N (msms) 08-131:编号为10 ;地方辣椒材料08032:编号为12 ；
检测方法按以下步骤进行:
1、辣椒基因组DNA的提取:取待检测辣椒样品苗期幼嫩叶片各0.02-0.05克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用；
2、基因组DNA的PCR扩增:用试剂盒提供的引物和试剂进行PCR扩增，扩增体积为104 1^;加入0嫩模板14 1^，2父Taq PCR MasterMix 5.μ L，上下游引物各0.25 yL，加无菌纯水至10 μ L ;扩增条件、程序同实施例1; 3、PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:各样品分别取扩增产物2.5 yL，并加入由试剂盒提供的上样缓冲液2.5 μ L，混匀；将混合物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，具体分析同实施例1 ;
4、辣椒样品恢复基因的检测:标记统计方法同实施例1(见图3)。
【主权项】
1.辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，该分子标记为pep43标记或pep20标记: P印43标记:上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示； P印20标记:上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
2.一种辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记的筛选方法，其特征在于该方法包括以下的步骤: 1)SSR分子标记的引物设计:在网站数据库SGN和ThePepper Genome Database中找分布于辣椒6号染色体上的SSR标记，并进行筛选；SSR标记主要是利用SSRHunter软件及gramene网站上SSRtool寻找重复序列，并用Primer5软件设计引物； 2)辣椒基因组DNA的提取:取辣椒131BC5AU39D-21-3亲本和F1、F2代各单株样品苗期幼嫩叶片0.02~0.05g克，按常规CTAB法提取DNA后，分别保存，备用； 3)基因组DNA的PCR扩增:在各PCR管中分别加入步骤2)提取的各辣椒样品基因组DNA I μ L后，再依次加入2X Taq PCR MasterMix 5.μ L，步骤I)设计的上下游引物各0.25 μ L，加无菌纯水至10 μ L，PCR反应程序:94°C 3 min预变性后，接着94°C变性30s，55°C退火30s，72°C延伸30s，35个扩增循环，最后72°C延伸5 min，产物4°C保存； 4)PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:各样品分别取扩增产物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚兰、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5 yL，混匀；将混合物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳；最后银染显色，进行观察，用数码相机拍照保存；共显性标记统计方法，与母本131BC5A —致的带型记为b，与父本139D-21-3 —致的带型记为a，杂合的带型记为h ； 5)筛选出与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记pep43和pep20:pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示，P印20标记的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示。
3.一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法，其特征在于该方法包括以下步骤: 1)根据目标基因筛选获得两个与辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁的分子标记，pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示,下游引物如SEQ ID NO:2所示，pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示，下游引物如SEQ ID NO:4所示； 2)辣椒基因组DNA的提取:将各待检测辣椒样品用CTAB法提取基因组DNA后，分别保存，备用； 3)PCR扩增反应体系:扩增反应的总体积为1yL, I μ L DNA模板，2Χ Taq PCRMasterMix 5.μ L, pep43标记或pep20标记的上、下游引物各0.25 yL,无菌纯水3.5yL;PCR反应程序为-MV 3 min预变性后，接着94°C变性30s，55°C复性30s，72°C延伸30s，35个扩增循环，最后72°C延伸5 min，产物4°C保存； 4)PCR扩增产物的聚丙烯酰胺凝胶电泳分析:各样品分别取扩增产物2.5 yL，并加入由1mM EDTA、0.25%溴酚兰、0.25% 二甲基苯菁和98%甲酰胺配制而成的上样缓冲液2.5μ L，混匀；将混合物在6%的非变性聚丙烯酰胺凝胶上进行电泳分离，至溴酚兰到达凝胶的底端处停止电泳；最后银染显色，进行观察、照相； 5)辣椒样品恢复基因的检测:按共显性标记统计方法，与母本131BC5A —致的带型记为b，与父本139D-21-3 —致的带型记为a，杂合的带型记为h，以确定辣椒样品是否具有恢复基因。
4.一种辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记的试剂盒，其特征在于:该试剂盒包括盒体和6支PCR管，在2支PCR管中分别装有2 X Taq PCR MasterMix和聚丙烯酰胺凝胶上样缓冲液，在其他4支PCR管中分别装辣椒雄性不育恢复基因的SSR分子标记方法用引物，所述的为pep43标记或pep20标记:pep43标记的上游引物序列如SEQ ID NO:1所示，下游引物如SEQ ID NO:2所示；pep20标记的上游引物序列如SEQ ID NO:3所示,下游引物如SEQ ID NO:4所示。
【专利摘要】本发明涉及生物技术辅助育种领域，尤其涉及辣椒雄性不育恢复基因<i>Rf</i><i></i>连锁的SSR标记及其在辣椒雄性不育育种材料选择中的应用。辣椒雄性不育恢复基因紧密连锁分子标记，该分子标记为pep43标记或pep20标记。SSR分子标记的开发可加速辣椒雄性不育的选育进程，提高育种效果，对辣椒CMS三系的分类和选育提供理论依据；采用自主开发的SSR引物和实验室常规的PCR？技术，通过对辣椒植株的检测，选出具有恢复基因的植株。该方法是对遗传物质的检测，方便、重复性好，且周年均可进行；本发明所提供的试剂盒，将检测用引物和相关试剂综合组装在一盒内，方便实施操作，检测结果稳定可靠。
【IPC分类】C12Q1-68, C12N15-11
【公开号】CN104561297
【申请号】CN201410839753
【发明人】叶青静, 杨悦检, 阮美颖, 王荣青, 周国治, 姚祝平, 李志邈, 万红建, 程远
【申请人】浙江省农业科学院
【公开日】2015年4月29日
【申请日】2014年12月29日