对维生素c的发酵生产的制作方法
【专利说明】对维生素C的发酵生产
[0001] 本发明是申请日为2006年2月10日、申请号为200680011688. 7、题为"对维生素 C的发酵生产"的申请的分案申请。
[0002] 本发明涉及多核苷酸和多肽作为生物技术工具在从微生物生产维生素C中的用 途，其中所述多核苷酸和/或被编码的多肽对在所述微生物中生产所述发酵产物的产率、 产量和/或效率有着直接或间接的影响。本发明还涉及经过遗传工程改造的微生物及其用 于直接生产维生素C的用途。
[0003] 维生素C是对人类来说非常重要且必不可少的营养因子。维生素C还用于动物饲 料，尽管一些畜牧动物可自身体内合成维生素C。
[0004] 在过去的70年中，已通过公知的Reichstein方法从D-葡萄糖对维生素C进行了 工业生产。该工艺中的所有步骤都是通过化学方式进行的，只除了其中一个步骤(从D-山 梨糖醇到L-山梨糖的转化)，其通过微生物转化来进行。从对维生素C的工业生产的最初 实践开始，就已使用了多种化学改良和技术改良，来提高Reichstein方法的效率。近来对 维生素 C 生产的发展被概括于 Ullmann's Encyclopedia of Industrial Chemistry, 5th Edition, Vol. A27 (1996)，pp. 547ff 中。
[0005] 维生素C生产的不同中间步骤已在微生物或从中分离出的酶的协助下进行。因 此，可通过发酵工艺，通过属于例如Ketogulonicigenium属或Gluconobacter属的菌株从 L-山梨糖起始来生产2-酮基-L-古洛酸（2-KGA，这是可通过碱性重排反应化学转化为维 生素C的中间产物)，或者通过属于Gluconobacter属或Pantoea属的重组菌株，从D-葡萄 糖起始进行另一种发酵工艺来生产2-酮基-L-古洛酸。
[0006] 目前用于对维生素进行化学生产的方法具有一些人们不想要的特征，例如高能耗 以及要使用大量的有机及无机溶剂。因此，在过去数十年中，人们已在研究更加经济且环保 的用微生物转化来制造维生素C的其它方法。
[0007] 从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和L-山梨糖酮)来发酵生产维生素C已 在多种微生物中被报道过，所述微生物例如藻类和酵母，其中使用了不同的培养方法。但 是，使用这些微生物的缺点在于产生的维生素C的低产率，这是因为已知这些微生物既能 生产2-酮基-古洛酸也能生产维生素C，所述微生物更容易合成2-KGA，因此通过微生物生 产的维生素C的产率受到相对高的2-KGA生产的限制，例如产生了小于0. 1的维生素C与 2-KGA浓度比。
[0008] 因此，人们需要开发出具有更好的工业应用性的生产体系，该体系例如可被操作 以获得提高的效价和/或具有减少的发酵时间。一种特别有用的体系运用了编码与膜结合 的L-山梨糖酮脱氢酶或与膜结合的PQQ结合D-山梨糖醇脱氢酶的基因。此类体系的一 个例子使用了来自Gluconobacter oxydansN44_l的编码L-山梨糖酮脱氢酶的基因（下文 中称为SNDHai)，该酶将L-山梨糖酮转化为L-抗坏血酸。该基因及其同源体已被描述于 W02005/017159中，该公开文本通过引用并入本文。
[0009] 人们持续需要进一步更优化的发酵体系，用于对维生素C进行微生物生产，以获 得比上文描述的体系更高的产率。
[0010] 令人吃惊地，我们发现，在合适的培养条件下，表达SNDHai的宿主细胞可用于进 一步优化对维生素C的直接生产。
[0011] 这可通过对特定组的基因进行同时操作来达到，在本文中将对这些基因进行进一 步描述。此类基因可选自由STS、RCS、SMS或VCS基因构成的组。该组基因/蛋白质以及对 每个组的操作将在本文中被进一步描述和举例。
[0012] 术语"直接发酵"、"直接生产"、"直接转化"等意指微生物能通过一个或多个生物 转化步骤将某底物转化为特定的产物，而无需任何额外的化学转化步骤。例如，术语"将 D-山梨糖醇直接转化为维生素C"意在描述下述过程，其中，微生物生产维生素C，并且，其 中，D-山梨糖醇作为碳源提供，而无需中间产物化学转化步骤。能直接发酵维生素C的单 种微生物是优选的。
[0013] 本文中使用的由遗传改变导致的"提高的"或"维生素c的提高的产率"表示较之 没有被遗传改变的微生物而言提高至少5%、10%、25%、30%、40%、50%、75%、100%、200%或者甚 至超过500%。此类未被改变的细胞通常也被称为野生型细胞。
[0014] 因此，在第一个方面，本发明的目的是提供一种对维生素c进行直接发酵生产的 方法，所述方法通过在合适的培养条件下培养其基因组已被遗传工程改造的宿主细胞，以 及通过从此类细胞或培养基分离维生素C来实现，所述遗传工程改造通过包含下述多核苷 酸的DNA序列来进行：
[0015] a)编码根据SEQIDN0 :2的L-山梨糖酮脱氢酶或活性片段或其衍生物的多核苷 酸，以及
[0016] b)编码选自下述组的蛋白质的至少一种多核苷酸，所述组由
[0017] 1)涉及山梨糖/ 山梨糖醇代谢系统（gorbitol/Sorbose Metabolization gystem， SMS)的蛋白质；
[0018] 2)涉及穿过细胞膜的糖转运系统（Sugar transport System, STS)的蛋白质；
[0019] 3)涉及呼吸链系统（Respiratory ￡hain gystem，RCS)的蛋白质；以及
[0020] 4)显示出与甘露糖-1-磷酸鸟苷酰转移酶/甘露糖-6-磷酸异构酶或肌氨酸氧化 酶a亚基或同渗容摩（osmolarity)传感器蛋白envZ rp426或转录调控蛋白OmpR或PetP 或肽去甲酰酶或天冬酰胺合酶的相似性的蛋白质
[0021] 构成。
[0022] 术语"遗传工程改造"或"遗传改变"表示对活的生物体中遗传物质结构的科学改 变。这包括生产和使用重组DNA。更特别地，这用于描述来自天然存在的生物而经遗传工程 改造或修饰的生物。遗传工程改造可通过本领域已知的多种方法来进行，例如，基因替换， 基因扩增，基因打断，使用质粒、病毒或其它载体进行的转化、转染。经遗传修饰的生物，例 如，经遗传修饰的微生物通常还被称作重组生物，例如重组微生物。
[0023] SMS蛋白是涉及山梨糖醇/山梨糖代谢系统（gorbitol/Sorbose Metabolization System)的蛋白。多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被缩写为SMS。SMS蛋白 在对D-山梨糖醇或L-山梨糖的直接代谢中发挥作用。
[0024] STS蛋白是涉及穿过细胞膜的糖转运系统（Sugar transport System)的蛋白。多 核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被缩写为STS。STS蛋白在对糖、糖醇和相关 化合物穿过细胞膜或周质膜的转运中发挥作用。
[0025] RCS蛋白是涉及呼吸链系统（Respiratory Qiain System)的蛋白。多核苷酸和这 些多核苷酸编码的蛋白质在本文中被缩写为RCS。RCS蛋白在生物的公知呼吸链(也被称为 电子转移系统）中发挥作用。
[0026] 根据（b. 4)的蛋白涉及维生素C生产系统（Yitamin ￡ production System)。根 据本发明的多核苷酸和这些多核苷酸编码的蛋白在本文中被缩写为VCS。迄今为止，人们没 有认识到VCS蛋白参与维生素C的生产，也没有认识到其参与与将碳源转化为维生素C相 关的生物化学途径。
[0027] 在一种优选的实施方式中，以下述方式对选自STS、RCS、SMS或VCS蛋白构成的组 的蛋白的活性加以操作，所述方式使得所述宿主细胞生产的维生素的产率和/或生产效率 较之所述蛋白的野生型副本有所提高。术语"操作"在本文中意欲包括对基因的遗传修饰 或改变，包括修饰其表达水平，优选通过分子生物学技术来进行。特别地，该术语意欲包括 对蛋白活性的上调或下调，此类调控可通过上调或下调编码该蛋白的基因来达成。上文详 细描述的用于上调或下调某蛋白活性的其它方法也可用于本发明的该实施方式。
[0028] 本发明的另一目的是提供包含此类多核苷酸的载体，特别是表达载体的形式。
[0029] 此外，本发明还有一个目的是提供生产经遗传工程改造的宿主细胞的方法，例如， 用此类DNA序列载体转化的宿主细胞。这可例如通过将本文示例的多核苷酸转移进重组或 非重组宿主细胞来实现，所述宿主细胞可以含有或可以不含相应基因的内源等同物。此类 经转化的细胞也是本发明的目的。
[0030] 从从属权利要求显而易见本发明的有利实施方式。本发明的这些方面和其它方 面、这些实施方式和其它实施方式对于本领域技术人员来说，应从本文教导显而易见。
[0031] 用作为外源核酸分子受体的任何细胞可用作为宿主细胞，例如携带可复制表达载 体或克隆载体的细胞或者通过公知技术进行了遗传工程改造或遗传改变以在其染色体或 基因组上含有想要的基因的细胞。宿主细胞可以是原核来源或真核来源的，例如细菌细胞、 动物细胞(包括人类细胞)、真菌细胞(包括酵母细胞)和植物细胞。优选地，宿主细胞是微生 物。更优选地，所述微生物属于能体内表达活性形式的L-山梨糖酮脱氢酶的细菌。
[0032] 在根据本发明改变后能以良好数量直接生产维生素C的已知细菌包括来自 Ketogulonicigenium、Pantoea、Pseudomonas或Escherichia或Corynebacterium属和乙 酸细菌的菌株。
[0033] 可用于本发明以提高对维生素C的直接生产的微生物可被公众从不同来源获得， 例如，Deutsche Sammlung von Mikroorganismen und Zellkulturen (DSMZ), Mascheroder WeglB, D_38124Braunschweig, Germany、American Type Culture Collection (ATCC), P. 0.Boxl549, Manassas, VA20108USA或Culture Collection Division, NITE Biological Resource Center, 2-5-8, Kazusakamatari, Kisarazu-shi, Chiba, 292-0818, Japan(以前是 Institue for Fermentation, Osaka(IF0), 17-85, Jus〇-honmachi2-chome, Yodogawa-ku, 0 saka532_8686, Japan)。保存到IF0的优选的细菌的例子例如是Gluconobacter oxydans(以 前被称为G.melanogenus)IF03293、Gluconobacter oxydans(以前被称为G.melanogenus) IF03292、Gluconobacter oxydans(以前被称为G. rubiginosus) IF03244、Gluconobacter frateurii(以前被称为G. industrius) IF〇326〇、Gluconobacter cerinus IFO3266、 Gluconobacter oxydans IF03287和Acetobacter aceti subsp. orleanus IF03259,上述 这些都于1954年4月5日被保藏；1975年10月22日保藏的Acetobacter aceti subsp. xylinum IF013693 和 1977 年 12 月 8 日保藏的 Acetobacter aceti subsp. xylinum IF013773。菌株Acetobacter sp.ATCC15164也是优选细菌的例子，其被保藏于ATCC。菌株 Gluconobacter oxydans (以前被称为G. melanogenus)N44_l是优选细菌的另一个例子，其 是菌株 IF03293 的衍生物，在 Sugisawa et al.，Agric, Biol. Chem. 54:1201-1209, 1990 中 对其有所描述。
[0034] 乙酸细菌在本发明中是优选的，以从大量底物(包括D-山梨糖醇、L-山梨糖和 L-山梨糖酮）以高产率直接生产维生素C。来自Gluconobacter, Gluconacetobacter和 Acetobacter属的菌株是进一步优选的，已发现它们能从L-山梨糖酮直接生产维生素C, 而发现至少Gluconobacter oxydans DSM17078能从D-山梨糖醇、L-山梨糖或L-山梨 糖酮直接生产维生素C。已按照《布达佩斯条约》，于2005