专利名称：一种稀土元素强化2-酮基-l-古龙酸高效生产的方法
技术领域：
一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高效生产的方法，涉及优化维生 素C发酵过程技术领域。
背景技术：
维生素C (Vitamin C，以下简称VC)又名L-抗坏血酸，是一种人体必需 的水溶性氨基酸，具有广泛的生理作用和理化性质，因此在医药、食品以及词 料等领域均有重要用途。同时，VC也是维生素类药物中发展最快、产量最大、 用途最广的品种。目前我国生产VC主要采用"二步发酵法"，该方法属于L-山梨糖途径，其特点为第二步发酵由酮古龙酸菌CSTetogw/om;gewz'Mm vw/g"re，通 称"小菌")与巨大芽孢杆菌(5ac!7/w mega^7'MW，通称"大菌")等伴生菌混 合发酵将L-山梨糖转化成VC前体2-酮基-L-古龙酸(2KGA)。
稀土元素又称稀土金属，包含钪Sc、钇Y及镧系中的镧La、铈Ce、镨Pr、 钕Nd、钷Pm、钐Sm、铕Eu、轧Gd、铽Tb、镝Dy、钬Ho、铒Er、铥Tm、 镱Yb、镥Lu，共17种元素，它们具有独特的理化性质。大量研究表明，稀土 元素对机体细胞的一些物质代谢过程和酶的活性有促进或抑制作用，但研究以 稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高效发酵生产的少见报导。
发明内容
本发明的目的是提供一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸(2KGA)高效生产 的方法，禾!j用酮古龙酸菌(Xefogw/o"fgew'w附vw/ga(re)与巨大芽孢杆菌(5"c"/us wegaten'wm)发酵生产2KGA，在发酵过程中添加适量的稀土离子，促进2KGA 的生产和山梨糖的消耗，达到2-酮基-L-古龙酸高效生产的目的。
本发明的技术方案 一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法， 利用酮古龙酸菌(《etogw/ow/gew/"w vw/gaw、小菌)与巨大芽孢杆菌(5ac/〃w mega^7'"附、大菌)混合菌系为生产菌株，发酵生产2-酮基-L-古龙酸，通过在 培养基中添加铈离子Ce"浓度至5mmol/L，或添加镧离子La"浓度至7mmol/L， 促进2-酮基-L-古龙酸的生产和山梨糖的消耗，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。
具体方法为
添加铈离子(Ce3+)浓度至5mmol/L， 2KGA的产量最终达到72.1g/L，发 酵周期缩短12h左右，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高23.5%、
27.1%;
或添加镧离子(La3+)浓度至7mmol/L， 2KGA的产量最终达到75.7g/L，发酵周期缩短12h左右，糖酸转化率从83.1%提高到91.6%，平均山梨糖消耗速 率和2KGA生成速率分别提高22.8%、 35.3%。
1、 菌株
酮古龙酸菌(iCeto^w/o"&em'ww vw/g。r。小菌)DSM 4205及巨大芽孢杆菌 (5acf〃w 大菌)ATCC 21916，由江苏江山制药有限公司(江苏靖
江)提供。
2、 培养基
种子培养基(重量％): L-山梨糖2.0(单独灭菌)、酵母膏0.3、蛋白胨l.O、 牛肉膏0.3、玉米浆0.15、尿素O.l、 CaCO3 0.1(单独灭菌)、MgS04.7H200.02、 KH2P04 0.1; pH 6.7-7.0, 121 。C灭菌15 min。
发酵培养基(重量％): L-山梨糖8.0 (单独灭菌)、玉米浆0.5、尿素1.2、 CaC03 0.5(单独灭菌)、MgS04.7H20 0.01、 KH2P04 0.1; pH 6.7-7.0， 121 °C灭 菌15 min。
3、 大菌与小菌混合菌系的培养
用接种环挑取新鲜平板上小菌单菌落两环，再挑取大菌单菌落一环，于无 菌水中制成混菌悬液，取混菌悬液涂斜面，30'C培养48h;取斜面混合菌接种于 种子培养液75 mL/750 mL三角瓶中。30°C、 200卬m下培养18h，即制成大小菌 混合菌系，接入甘油管中进行保藏。
4、 摇瓶培养
将30'C、 200rpm下培养18h的种子以10%的接种量转接入发酵培养基于30 °C、 200rpm条件下培养72h,按实验要求添加不同浓度的镧离子(La3+)或铈离 子(Ce3+)。
菌体浓度的测定取一定量的发酵液，加适量盐酸溶解发酵液中的碳酸钙， 加入去离子水将其稀释10倍，摇匀，用UV7500型可见分光光度计，于660nm 处比色测OD值。
2-酮基-L-古龙酸和山梨糖的测定高效液相色谱(HPLC)
仪器AgilentllOO高效液相色谱仪(配紫外可见检测器、视差折光检测器 和工作站)，色谱条件
色谱柱Aminex HPX-87H columns(300 mmx7.8 mm)
流动相1.1mL浓硫酸稀释到4L
'流速0.5mL/min
柱温35°C
进样量5
视差折光检测器波长210 nm
样品制备发酵液在12000 rpm下离心5min，取适量上清液，用超纯水稀释10倍，经0.45 pm滤膜过滤后，滤液供液相色谱分析用。
本发明的有益效果利用本发明能强化2-酮基-L-古龙酸的发酵生产。2-酮 基-L-古龙酸的产量最高能从67.0g/L提高到75.7g/L，縮短发酵周期12h左右， 糖酸转化率从83.1%提高到91.6%，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别 提高22.8%、 35.3%。本发明的稀土元素强化发酵高效生产的方法对其它发酵产 品的生产具有一定的指导意义。
图l添加5ihmol/L铈离子(Ce3+)时对2KGA发酵的影响。 图2添加7mmol/L镧离子(La3+)时对2KGA发酵的影响。
具体实施例方式
对照实施例本发明所用的菌种为酮古龙酸菌(KefogM/c^gem'Mm vw/gare)与 巨大芽孢杆菌(A^7/ws megfl^7'wm)混合菌系。从冷冻甘油管中取混菌保藏培养 物0.4mL接入种子培养基(75mL/750mL摇瓶)，30°C， 200rpm培养18h。再 以10。/。的接种量接入发酵培养基(75mL/750 mL摇瓶)，30°C ， 200 rpm培养72 h。 此发酵条件下，最终2KGA和山梨糖浓度分别为67.0gl"， 10.7g丄人
实施例1:在发酵培养基中添加铈离子(Ce3+)浓度达到5mmol/L时，如图 1,发酵60h后2KGA和L-山梨糖浓度就分别达到了72.1g丄"，8.4g丄"，平均山 梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别比对照组提高了23.5。/。、 27.1%。继续提高 培养基中铈离子(Ce3+)浓度时，2KGA的产量则会有所下降。
实施例2:在发酵培养基中添加镧离子(La3+)浓度达到7mmoI/L时，如图 2，发酵60h后2KGA和L-山梨糖浓度就分别达到了 75.7 g七人8.9g丄"，糖酸 转化率从83.1%提高到91.6%，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高 了 22.8%、 35.3%。继续提高培养基中镧离子(La3+)浓度时，2KGA的产量则 会有所下降。
权利要求
1、一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，其特征是利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，发酵生产2-酮基-L-古龙酸，通过在培养基中添加铈离子Ce3+浓度至5mmol/L，或添加镧离子La3+浓度至7mmol/L，促进2-酮基-L-古龙酸的生产和山梨糖的消耗，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。
全文摘要
一种稀土元素强化2-酮基-L-古龙酸高效生产的方法，属于优化维生素C发酵过程技术领域。本发明利用酮古龙酸菌(Ketogulonigenium vulgare)与巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)混合菌系为生产菌株，通过在培养基中添加铈离子Ce<sup>3+</sup>，或添加镧离子La<sup>3+</sup>，促进2-酮基-L-古龙酸(2KGA)的生产和山梨糖的消耗，实现2-酮基-L-古龙酸高效生产。添加5mmol/L的铈离子，2KGA的产量由对照例的67.0g/L提高到72.1g/L，发酵周期缩短12h左右，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高23.5％、27.1％；添加7mmol/L的镧离子，2KGA的产量提高到75.7g/L，发酵周期缩短12h左右，糖酸转化率从83.1％提高到91.6％，平均山梨糖消耗速率和2KGA生成速率分别提高22.8％、35.3％。
文档编号C12R1/11GK101671715SQ20091003444
公开日2010年3月17日 申请日期2009年8月28日 优先权日2009年8月28日
发明者杰 刘, 刘立明, 周景文, 郑巧双, 坚 陈 申请人:江南大学