专利名称：一种丁二酸的发酵生产工艺的制作方法
技术领域：
本发明属于生物发酵技术领域，具体涉及丁二酸的发酵生产工艺。
背景技术：
丁二酸又称琥珀酸，是一种重要的C4平台化合物，是一种常用的工业原料，广泛 用于合成塑料、橡胶、染料、制药、食品加工和其它领域中，现有的市场规模超过400万吨/每年。传统的丁二酸生产方法，是使用不可再生的化石原料，经化学合成而来；由于化石 原料的匮乏以及不可再生性，限制了丁二酸的进一步应用。丁二酸也可以由微生物使用可 再生资源葡萄糖、秸秆等为原料，经生物加工固定CO2合成；由于发酵法效率高、可减缓温室 效应以及原料可持续利用等优点，正被广泛深入的研究。然而目前只有食品行业的丁二酸 是发酵生产的，若降低微生物发酵法生产丁二酸的成本，实现用丁二酸取代很多基于苯和 石化中间产物的商品，这不仅可以减少超过250种苯基化学制品的生产和消费过程中所产 生的污染，还可以缓解石油化石资源的压力，实现可持续发展，进一步扩大丁二酸的市场容 量。目前已经报道的用于发酵产丁二酸菌种主要有A. succiniciproducens, E. coli, C. glutamicum, M. succiniciproducens, A. succinogenes。这些微生物都是通过糖酵解途 径，分解葡萄糖生成丙酮酸等中间体，再经羧化酶固定CO2生成草酰乙酸，进一步生成苹果 酸、富马酸，最终还原成丁二酸。研究表明，在CO2供给不足的情况下，丁二酸的产量明显降 低，而主要生成副产物乳酸、乙酸，而CD2主要通过添加MgCO3, CaCO3, Na2CO3, NaHCO3 (持续通 CO2并同时利用NaOH调节pH固定CO2)等碳酸盐的方式来供给。目前，NaHCO3或者Na2CO3 (持续通(X)2并同时利用NaOH调节pH固定CO2)由于其 生产效率高，效果好等优点已被广泛用于发酵产丁二酸。但是由于其发酵终点含有大量钠 盐，造成钠盐污染，增加发酵终点废液处理的成本，同时大规模的发酵生产丁二酸需要大量 的碳酸盐或者NaOH，选择低廉、可回收利用的碳酸盐成为降低工业生产成本的关键因素。
发明内容
本发明所要解决的问题是提供一种丁二酸的发酵生产工艺，该工艺使用可回收利 用的碳酸盐以降低经济成本，利于废液处理。为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下一种丁二酸的发酵生产工艺，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，先进行好氧富集，再进 行厌氧发酵生产丁二酸，在厌氧发酵过程中CO2的提供以添加NH4HC03、或(NH4)2C03、或NH4OH 与(X)2的形式，或上述三种形式中任意两种或三种的组合。其中，好氧富集阶段的发酵条件为30 35°C下好氧发酵12 14h，通气1 2v/ vm、搅拌转速为300 600rpm。其中，好氧富集阶段，发酵培养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/L, KH2PO4 0. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2 lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L，生物素 0. 2mg/L，维生素 Bl 200 μ g/L, 初始pH 6.5。其中，厌氧发酵生产丁二酸阶段是在好氧富集阶段结束后，在培养基中继续添加 葡萄糖至30 90g/L ；同时添加NH4HCO3、或(NH4) 2C03、或NH4OH与CO2,或上述三种形式中任 意两种或三种的组合，其添加总量约为30 100g/L ；30 35°C下厌氧发酵12 40h，搅拌 转速为300 600rpm，发酵生产丁二酸。优选的，NH4OH与(X)2的摩尔比相同。冊4!10)3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与(X)2在发酵法生产丁二酸的工业生产中具有很大 的市场潜力，主要表现在首先，目前NH3的合成技术趋于成熟，年产量大，使得NH4HCO3、或 (NH4) 2C03、或利用NH4OH固定(X)2生成NH4HCO3具有很大的储备量，保证其在碳酸氢盐化学物 质中价格最低；其次，发酵终点时采用膜分离法，将发酵液经微滤、超滤后，得到澄清的琥珀 酸溶液，利用盐酸调节PH2. 0 3. 5，浓缩结晶得到琥珀酸晶体，同时得到高纯度的NH4Cl晶 体，可循环利用于其他工业生产，废液经蒸发结晶后作为氮肥应用为农业生产中，不仅降低 了工业生产丁二酸的成本，还几乎对环境不造成压力。因此在工业生产中使用NH4HCO3、或 (NH4)2C03、或者考虑使用NH4OH固定CO2，调控pH发酵生产丁二酸具有很大社会和经济效益。工业中使用的产丁二酸菌株大多数不耐受高浓度的铵盐，如高浓度的NH4+影响 E. coli和A. succinogenes生长和抑制丁二酸的合成代谢。主要是因为在高浓度的NH4+环 境下，一方面细胞为了维持胞内PH的稳定，需要供应更多的能量，不利于细胞的生长甚至 导致细胞的死亡；另一方面NH4+通过作用于糖代谢途径中的多个位点抑制细胞的合成代 谢，影响丁二酸的生产强度以及产率。而申请人意外发现谷氨酸棒杆菌却可以在高浓度的 铵盐环境下生长，厌氧条件下分解葡萄糖主要生成丁二酸，副产物种类少产量低，整个产丁 二酸的过程为净消耗。这些优势使得谷氨酸棒杆菌具有良好的丁二酸生产潜力。有益效果本发明与现有技术相比具有如下优势1、与其他菌种相比，谷氨酸棒杆菌具有很高的NH4+耐受性，这为使用以NH4HCO3形 式固定(X)2提供了前提。2、与NaHCO3, MgCO3, CaCO3等其他中和剂相比，NH4HCO3价格低廉，工业生产上能够 降低生产成本，并且以NH4OH来固定(X)2发酵生产，方法简便，进一步降低成本，带来巨大的 经济效益。3、利用本发明的方法，最终回收有机酸时，避免大量金属离子的污染处理问题，同 时可以回收利用NH4Cl,或者由于废液成分简单，可以制成氮肥，用于农业生产，从而在产品 处理上节约成本，同时降低环境污染。
具体实施例方式根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的具体的物料配比、工艺条件及其结果仅用于说明本发明，而不应当也不会限 制权利要求书中所详细描述的本发明。实施例1 将谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum ATCC 13032)活化后，按照 3%
4(ν/ν)接种量转接入3L发酵培养基，通空气lv/vm，转速500rpm，30°C，好氧发酵1 后，补 加至30g/L的葡萄糖与40g/L的NH4HCO3,转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30°C。厌 氧发酵Uh。其中，发酵培养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,维生素 Bl 200 μ g/L，初始 ρΗ6· 5。发酵结果，主要转化产物为乳酸、乙酸和丁二酸，其产量分别为14. 93g/L、2. 37g/ L、9. 63g/L，丁二酸生产强度为 1. Mg*!/1*!!-1，丁二酸综合质量产率为 0. 51g/g (glucose)。实施例2 将谷氨酸棒杆菌(保藏号为CGMCC NO. 3991)活化后，按照3% (ν/ν)接种量转接 入3L发酵培养基，通空气lv/vm，转速500rpm，30°C，好氧发酵1 后，补加至80g/L的葡萄 糖与30g/L的NH4HCO3,转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30°C，并以2. Sg^L"1^1的 流量流加NH4HCO3,厌氧发酵40h。其中，发酵培养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,维生素 Bl 200 μ g/L,初始 ρΗ6· 5。发酵结果，主要转化产物为乙酸和丁二酸，其产量分别为11.56g/L和55.47g/L， 丁二酸的生产强度为1. Sgg^-Sh-1, 丁二酸综合质量产率为0. 70g/g (glucose)。实施例3 将谷氨酸棒杆菌(保藏号为CGMCC NO. 3991)活化后，按照3% (ν/ν)接种量转接 入3L发酵培养基，通空气lv/vm，转速500rpm，30°C，好氧发酵1 后，补加至60g/L的葡萄 糖与30g/L的NH4HCO3,转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30°C，持续通CO2，并以NH4OH 调节PH值固定CO2，控制pH值为7. 0，厌氧发酵36h。其中，发酵培养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,维生素 Bl 200 μ g/L,初始 ρΗ6· 5。发酵结果，主要转化产物为乙酸和丁二酸，其产量分别为8. 62g/L和41. 32g/L，丁 二酸的生产强度为1. ISg^-Sh-1, 丁二酸综合质量产率为0. 69g/g (glucose)。实施例4 将谷氨酸棒杆菌(保藏号为CGMCC N0. 3991)活化后，按照3% (ν/ν)接种量转接 入3L发酵培养基，通空气lv/vm，转速500rpm，30°C，好氧发酵1 后，补加至30g/L的葡萄 糖与30g/L的(NH4)2CO3,转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30°C，厌氧发酵20h。其中，发酵培养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,维生素 Bl 200 μ g/L,初始 ρΗ6· 5。发酵结果，主要转化产物为乙酸和丁二酸，其产量分别为5. 53g/L和20. 63g/L，丁 二酸的生产强度为1. OSg^-1*!!-1, 丁二酸综合质量产率为0. 69g/g (glucose)。实施例5 将谷氨酸棒杆菌(Corynebacteriumglutamicum 1006)活化后，按照 3% (ν/ν)接种量转接入3L发酵培养基，通空气lv/vm，转速500rpm，30°C，好氧发酵1 后，补加至30g/ L的葡萄糖，转入厌氧发酵，转速200rpm，温度控制在30°C，并将CO2气体以0. 2v/vm的通气 速率流入发酵罐的厌氧发酵培养基中，同时以NH4OH调节pH值，控制pH值为7. 0，厌氧发酵 1 后，补加葡萄糖至30g/L，厌氧发酵观小时后，继续补加葡萄糖至30g/L，厌氧发酵50h。其中，发酵培养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/ L, KH2PO4 0. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L,生物素 0. 2mg/L,维生素 Bl 200 μ g/L，初始 ρΗ6.5。发酵结果，主要转化产物为乳酸，乙酸和丁二酸，其产量分别为37. 59g/L， 12. 12g/L和33. 73g/L，丁二酸的生产强度为0. eTg^-1^-1, 丁二酸综合质量产率为0. 40g/ g(glucose)。
权利要求
1.一种丁二酸的发酵生产工艺，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，先进行好氧富集，再 进行厌氧发酵生产丁二酸，其特征在于在厌氧发酵过程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或 (NH4)2CO3、或NH4OH与CO2的形式，或上述三种形式中任意两种或三种的组合。
2.根据权利要求1所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于好氧富集阶段的发酵条 件为30 :35°C下好氧发酵12 14h，通气1 2v/vm、搅拌转速为300 600rpm。
3.根据权利要求1所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于好氧富集阶段，发酵培 养基包括如下组分葡萄糖20g/L，尿素2. 5g/L，K2HPO4 · 3H20 1. 5g/L，KH2PO4O. 5g/L，无水 MgSO4 0. 4g/L, FeSO4 · 7H20 6mg/L, MnSO4 · H2O 6mg/L, ZnCl2 lmg/L, CuSO4 0. 2mg/L, CaCl2 0. 2mg/L，生物素 0. 2mg/L，维生素 Bl 200μ g/L，初始 pH 6. 5。
4.根据权利要求1所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于厌氧发酵生产丁二酸阶 段是在好氧富集阶段结束后，在培养基中继续添加葡萄糖至30 90g/L ；同时添加NH4HC03、 或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2,或上述三种形式中任意两种或三种的组合，其添加总量约为 30 100g/L，30 :35°C下厌氧发酵12 40h，搅拌转速为300 600rpm，发酵生产丁二酸 酸。
5.根据权利要求1或4所述的丁二酸的发酵生产工艺，其特征在于NH4OH与(X)2的摩 尔比相同。
全文摘要
本发明公开了一种丁二酸的发酵生产工艺，以谷氨酸棒杆菌为生产菌株，先进行好氧富集，再进行厌氧发酵生产丁二酸，在厌氧发酵过程中CO2的提供以添加NH4HCO3、或(NH4)2CO3、或NH4OH与CO2的形式，或上述三种形式中任意两种或三种的组合。利用本发明的方法，最终回收有机酸时，避免大量金属离子的污染处理问题，同时可以回收利用NH4Cl，或者由于废液成分简单，可以制成氮肥，用于农业生产，从而在产品处理上节约成本，同时降低环境污染。
文档编号C12P7/46GK102146422SQ201110025759
公开日2011年8月10日 申请日期2011年1月24日 优先权日2011年1月24日
发明者严明, 安明东, 李艳, 欧阳平凯, 蔡萍, 许晟, 郝宁, 郝思清 申请人:南京工业大学