一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素k2中的应用的制作方法
【专利摘要】本发明公开了一种纳豆芽孢杆菌，其分类命名为纳豆芽孢杆菌(Bacillus natto)，已保藏于中国典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2014405。该菌种分离自市场上购买的纳豆产品，后经紫外诱变筛选获得，该菌种可高效利用大豆蛋白合成维生素K2；本发明还公开了利用上述纳豆芽孢杆菌生产维生素K2油脂的方法。本发明采用新型供氧策略优化菌种发酵工艺，并进行发酵罐放大，最终维生素K2产量达到60.54mg/L，相对于大豆蛋白的转化率为2.018mg/g，生产成本低。通过本发明方法可高效生产维生素K2油脂，整套工艺简单，操作方便，生产周期短，维生素K2含量较高，降低了发酵成本，适合工业化生产。
CCTCC M 2014405
2014.09.09
【专利说明】一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素K2中的应用
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种纳豆芽孢杆菌及其在发酵生产维生素K2中的应用，属于生物技 术领域。
【背景技术】
[0002] 维生素K2是一类脂溶性凝血类维生素，为甲萘醌类系列化合物，因其在食品中含 量极少，素有"钼金维生素"之称，在骨质疏松症的预防和治疗方面具有显著的效果，被称 为"第四代抗骨质疏松产品"。维生素K2的生物活性主要体现在促进凝血酶原的产生和增 加骨钙素的合成上，在血液凝固以及骨骼代谢方面有重要作用，可用于治疗和预防维生素K 缺乏引起的出血、动脉钙化、骨关节炎及骨质疏松症等疾病，在增加人体骨密度方面优于其 他维生素K。近年来，对其生理功能的研究和认识又进一步加深，维生素K2还可防止肝硬 化、肝纤维化转化为肝癌，促进肝细胞再生，同时在预防和治疗帕金森症方面也具有一定的 疗效。维生素K2作为人体内源性高活性维生素，其安全性已得到美国FDA、中国食品药品监 督管理局、美国药品研究所及欧洲议会和欧盟理事会的权威认定。
[0003] 维生素K2是一类化合物--甲基萘醌类化合物，根据其分子结构上C-3位异戊二 烯侧链的长短不同共有14种形式，以MK-n表示（n指侧链上异戊二烯单位的个数），甲萘 醌-4(MK-4)和甲萘醌-7(MK-7)最为常见，MK-4与维生素K1分子量相似，均具有很短的血 清半衰期，要实现血液循环需要很大的剂量，比MK-7推荐剂量高1000倍。而MK-7可快速 被肠道吸收，由大的脂质颗粒所运输，在循环系统中停留很长时间，血液半衰期长，有能力 在除肝脏外的骨骼和动脉中发挥作用。
[0004] 以往维生素K2主要通过化学合成，而化学法合成的维生素K2其异戊二烯侧链多 是顺式结构，活性较低，而活性更高的天然维生素K2 (MK-7)仅能通过微生物发酵法获得。 为满足维生素K2不断增长的市场需求、克服化学法来源维生素K2的缺点，近年来，科学工 作者开展了利用微生物发酵生产维生素K2的研究。主要包括利用纳豆芽孢杆菌、黄杆菌 等，本发明所采用的菌种为纳豆芽孢杆菌，用来制备MK-7型的维生素K2。纳豆芽孢杆菌并 非分类学上的名称，隶属于枯草芽孢杆菌（Bacillus subtilis)。该菌为美国FDA公布的 40种益生菌之一，食用安全，是维生素K2生产的优良菌种，引起国内外学者的广泛关注。
[0005]目前国内关于维生素K2制备的专利主要集中：（1)化学法合成；（2)微生物发酵 法；CN101605883B主要利用乳酸菌生产，CN201310521459. 1，CN103290077A主要利用黄杆 菌制备MK-4的维生素K2。而关于纳豆芽孢杆菌的专利主要集中在：（1)固态发酵制备饲料 添加剂；（2)制备纳豆激酶、合生素等功能性产品；仅两篇与本专利有关，CN 102827798A公 开了一种可高产维生素K2的纳豆芽孢杆菌，主要通过紫外、化学诱变以及原生质融合方法 提高菌种生长速率及VK2产量；CN103898175A也公开了一种纳豆芽孢杆菌以及提纯维生素 K2的方法，发明点主要在提纯方法上，未提及维生素K2的发酵指标。以上专利没有详细研 究直接影响维生素K2积累的关键因素，导致产量不高，产业化难度较大。低的生产效率增 加了生产成本，致使微生物来源的维生素K2价格昂贵。维生素K2为胞内产物，生物量是高 产的关键，生物量的提高主要依赖营养元素的供应，而维生素K2的发酵原料成本主要来自 于氮源，大豆蛋白胨的价格70元/Kg，碳源甘油仅9元/Kg，因此，增加氮源对维生素K2的 转化率是降低原料成本的关键。综上，获得维生素K2的高产菌株，并结合优良的发酵工艺， 获得较高的生物量和维生素K2含量，并提高原料（特别是氮源）对维生素K2的转化率，是 维生素K2的工业化推广的关键所在。
【发明内容】
[0006] 本发明所要解决的技术问题是提供一种自主筛选的、能高产维生素K2的纳豆芽 孢杆菌。
[0007] 本发明还要解决的技术问题是提供上述纳豆芽孢杆菌在发酵生产维生素K2中的 应用。
[0008] 为解决上述技术问题，本发明采用的技术方案如下：
[0009] 一种纳豆芽孢杆菌，其分类命名为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)，已保藏于中 国典型培养物保藏中心（简称CCTCC)，地址：中国武汉武汉大学，邮编：430072,其保藏编号 为CCTCC M 2014405,保藏日期为2014年9月9日。该纳豆芽孢杆菌从江苏省南京市市场 上购买的纳豆产品中获得，后经紫外诱变，筛选获得蛋白酶活性较高菌种。
[0010] 通过该菌株发酵制备的维生素K2为MK-7型。
[0011]纳豆芽孢杆菌CCTCC M 2014405菌株特性如下：
[0012] (1)菌落形态：将菌种稀释涂布在固体培养基上，30-37°C培养，24h后，菌落表面 粗糙不透明，污白色或微黄色；
[0013] (2)菌体形态：在光学显微镜下观察CCTCC M 2014405的形态及结构，菌体为杆 状，单个细胞长〇. 5-3微米，革兰氏阳性菌，好氧，含有芽孢，位于菌体中央或稍偏；
[0014] (3)液体培养：静置培养表面会产生一层白色的生物膜，震荡培养细胞生长速度 快，无白色膜；
[0015] (4)代谢：主要代谢产物为七烯甲基萘醌构型的维生素K2,该菌株在25-40°C均能 生长，其中30-37°C为最适生长温度；菌体适合在中性pH培养液中生长。
[0016](5)胞外酶：可产生蛋白酶、淀粉酶、纤维素酶等，可分解胞外含氮原料，如大豆 粉、菌渣等。
[0017] 通过形态及培养特性判定本菌为芽孢菌属的微生物，为进一步对所获得的菌株进 行鉴定，借用分子生物学手段对其16SRNA序列（如SEQ ID N〇:l所示）进行比对。发现本 菌与8&(^11118 8油^118的1651?嫩序列存在96%的同源性，因此判定本菌株属于芽孢杆 菌，命名为 Bacillus natto R127。
[0018] 上述纳豆芽孢杆菌在发酵生产维生素K2中的应用。
[0019] 其中，所述的维生素K2为MK-7型。
[0020] 具体的发酵生发方法为，CCTCC M 2014405菌株为出发菌株，在液体培养基中进行 高密度发酵，分别对收集的细胞和滤液进行提取获得富含维生素K2的油脂。
[0021] 其中，所述的高密度发酵，包括如下步骤：
[0022] (1)将保存在甘油管的菌株接入固体培养基中进行菌种活化，37°C培养箱中培养， 20?28h，连续活化两代；
[0023] (2)利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有50mL种子培养基的 250mL摇瓶中，在30?37°C的摇床中，以120?200rpm的转速，培养24?48h，获得一级种 子液；
[0024] (3)将一级种子接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量2?10% (v/ v)在30?37°C的摇床中，以160?250rpm的转速，培养18?24h，获得二级种子液；
[0025] (4)将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2?10% (v/v)，加入消 泡剂，通气量0. 2?2vvm，搅拌转速200?600rpm，罐温30?37°C，培养64?96h，发酵生 产维生素K2。
[0026] 步骤（1)、（2)或（3)中，所述的固体培养基配方为：30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨， 5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，30g/L琼脂，溶剂为水。种子培养基配方为10-50g/ L葡萄糖，20-80g/L蛋白胨，2-10g/L NaCl，2-10g/L牛肉膏，2-10g/L酵母膏，溶剂为水。种 子培养基优选配方为：30g/L葡萄糖，40g/L蛋白胨，5g/L NaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏， 溶剂为水。发酵培养基配方为30-80g/L甘油，20-100g/L大豆蛋白胨，0. 2-1. 5g/L酵母粉， 0. l-lg/LK2HP04,0. l-lg/LCaCl2 ?%0,0. l-lg/LMgS04 *7H20,溶剂为水。发酵培养基优选配方 为：50g/L 甘油，30g/L 大豆蛋白胨，0? 6g/L 酵母粉，0? 3g/LK2HP04,0. lg/LCaCl2 ? H20,0. 3g/ LMgS04 ? 7H20,溶剂为水。
[0027] 步骤（4)中，所述的消泡剂为silicone SE-2,使用量为0?2_3g/L，优选0?3g/L。
[0028] 步骤（4)中，发酵罐中发酵产维生素K2油脂采用间歇式发酵或补料式发酵方法。
[0029] 步骤（4)中，发酵罐采用养鱼用的气石（微孔分布器）作为气体分布器。
[0030] 其中，所述的提取，包括如下步骤：
[0031] (I)经微滤设备浓缩发酵液，获得浓缩后的菌体细胞，细胞密度高于l〇〇g/L，均质 机机械破碎；
[0032] (II)滤液进行纳滤，截留分泌至胞外的维生素K2 ;
[0033] (III)将步骤（I)和（II)所得破碎细胞和截留液加有机溶剂搅拌，萃取；
[0034] (IV)将有机溶剂减压蒸发，获得富含维生素K2油脂。
[0035] 步骤（III)中，所述的有机溶剂为正己烷、石油醚、乙醇、异丙醇和乙醚中的任意 一种或几种的混合，优选异丙醇和正己烷按体积比1 :〇. 5?2的混合物。
[0036] 通过本发明方法生产维生素K2,最终维生素K2的含量达58. 64mg/L，相对于大豆 蛋白胨的转化率为1.955mg/g。
[0037] 本发明所采取的工艺方法同样适用于纳豆芽孢杆菌同均属的其他菌株以及在此 基础上进行诱变获得的菌种，如Bacillus subtilis CICC10262、Bacillus subtilis CGMCC NO. 8400 等，最适的菌种为 CCTCC M 2014405。
[0038] 有益效果：本发明从自主筛选的菌株CCTCC M 2014405出发，在详细研究菌种生 长特性基础上，采用新型供氧策略优化发酵过程，利用养鱼所用的气石作为发酵罐气体分 布器，强化供氧效果，进而提供了一种高效生产维生素K2的方法，并适合大规模生产，最 终维生素K2的含量达58. 64mg/L，相对于大豆蛋白胨的转化率为1. 955mg/g，生产成本较 低。同时，本发明还提供了一种从纳豆芽孢杆菌中提取维生素K2油脂的方法，提取收率在 90-95%左右。整套工艺简单，操作方便，发酵过程转速低于300rpm，能耗较低，降低了发酵 成本，适合工业化生产。
【专利附图】
【附图说明】
[0039] 图1为发酵样品液相图谱。
[0040] 图2为发酵样品维生素K2 (MK-7)质谱图。
【具体实施方式】
[0041] 根据下述实施例，可以更好地理解本发明。然而，本领域的技术人员容易理解，实 施例所描述的内容仅用于说明本发明，而不应当也不会限制权利要求书中所详细描述的本 发明。
[0042] 实施例1 :菌株筛选
[0043] 取lg纳豆产品溶解于100ml生理盐水中，振荡混合均匀，将样品悬液按照每级稀 释10倍的次序制得lO-i-lO- 7个浓度，分别将1〇_3-1〇-7五个浓度中吸取100U1稀释液加到 筛选培养基中涂布，每个浓度涂三块板，37 °C，培养48h，挑选可产生水解圈且较大的菌落， 继续在筛选培养基中划线，获得纯菌，经发酵复筛，高效液相分析及质谱鉴定，获得可产维 生素K2的菌种Bacillus natto R，且该菌株所产维生素K2为MK-7构型（如图1，2)。
[0044] 为提高菌种分解蛋白的能力，对所得Bacillus natto R进行诱变筛选：将活化 后的菌液用生理盐水洗涤，将菌悬液在紫外灯下照射，照射距离30cm，每隔20s取样，最后 选择180s，致死率在80%左右的条件进行诱变筛选，所得诱变菌液稀释涂布在筛选培养基 中，筛选透明圈较大的菌株，命名为Bacillus natto R127,保藏于中国典型微生物菌种保 藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2014405。
[0045] 筛选培养基为：4g干酪素溶于100ml水中，115°C灭菌20min，牛肉膏3g，蛋白胨 10g，NaCl 5g，琼脂20g，溶于900ml水中，121 °C，灭菌20min，冷却至50°C左右，将两者混合， 倒平板待用。
[0046] HPLC方法：色谱柱：C18柱，柱温：50°C，流动相：甲醇，流速：lml/min，紫外检测波 长270nm，进样量：30ul，检测时间：35min。
[0047] 实施例2:菌株基本生长性能考察。
[0048] 对筛选获得的菌株CCTCC M 2014405进行基本性能考察，采用不同液体种子培养 基进行培养，考察细胞生长速率，结果如表1，所用培养基为（％表示每l〇〇ml培养基中含有 物质的质量g):
[0049] 培养基1:10〇1^豆芽汁，5%蔗糖
[0050] 培养基2 :1%葡萄糖，1%蛋白胨，0? 5% NaCl
[0051] 培养基3 :3%葡萄糖，4%蛋白胨，0. 5% NaCl，0. 5%牛肉膏，0. 5%酵母膏
[0052] 培养基4 :0. 5%葡萄糖，1%蛋白胨，0. 5% NaCl，0. 5%牛肉膏，0. 5%酵母膏
[0053] 表1不同种子培养基菌体生长情况表
[0054]
【权利要求】
1. 一种纳豆芽孢杆菌，其分类命名为纳豆芽孢杆菌（Bacillus natto)，已保藏于中国 典型培养物保藏中心，其保藏编号为CCTCC M 2014405,保藏日期为2014年9月9日。
2. 权利要求1所述的纳豆芽孢杆菌在发酵生产维生素K2中的应用。
3. 根据权利要求2所述的应用，其特征在于，所述的维生素K2为MK-7型。
4. 根据权利要求2或3所述的应用，其特征在于，CCTCC M 2014405菌株为出发菌株， 在液体培养基中进行高密度发酵，分别对收集的细胞和滤液进行提取获得富含维生素K2 的油脂。
5. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的高密度发酵，包括如下步骤： (1) 将保存在甘油管的菌株接入固体培养基中进行菌种活化，37°C培养箱中培养， 20?28h，连续活化两代； (2) 利用灭菌后的生理盐水将斜面上的菌洗下，接入装有50mL种子培养基的250mL摇 瓶中，在30?37°C的摇床中，以120?200rpm的转速，培养24?48h，获得一级种子液； (3) 将一级种子接入装有100mL种子培养基的500mL摇瓶中，接种量2?10 % (v/v) 在30?37°C的摇床中，以160?250rpm的转速，培养18?24h，获得二级种子液； (4) 将二级种子接入装有发酵培养基的发酵罐中，接种量2?10 % (v/v)，加入消泡剂， 通气量0. 2?2vvm，搅拌转速200?600rpm，罐温30?37°C，培养64?96h，发酵生产维 生素K2。
6. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，所述的固体培养基配方为30g/L葡萄糖， 40g/L蛋白胨，5g/LNaCl，5g/L牛肉膏，5g/L酵母膏，30g/L琼脂，溶剂为水；种子培养基配 方为 10-50g/L 葡萄糖，20-80g/L 蛋白胨，2-10g/L NaCl，2-10g/L 牛肉膏，2-10g/L 酵母膏， 溶剂为水；发酵培养基配方为30-80g/L甘油，20-100g/L大豆蛋白胨，0. 2-1. 5g/L酵母粉， 0? l-lg/LK2HP04,0. l-lg/LCaCl2 ? H20,0. l-lg/LMgS04 ? 7H20,溶剂为水。
7. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤⑷中，所述的消泡剂为 siliconeSE-2,使用量为 0? 2-3g/L。
8. 根据权利要求5所述的应用，其特征在于，步骤（4)中，发酵罐中发酵产维生素K2油 脂采用间歇式发酵或补料式发酵方法；发酵罐采用微孔分布器作为发酵罐的气体分布器。
9. 根据权利要求4所述的应用，其特征在于，所述的提取，包括如下步骤： (I) 经微滤设备浓缩发酵液，获得浓缩后的菌体细胞，细胞密度高于l〇〇g/L，均质机机 械破碎； (II) 滤液进行纳滤，截留分泌至胞外的维生素K2 ; (III) 将步骤（I)和（II)所得破碎细胞和截留液加有机溶剂搅拌，萃取； (IV) 将有机溶剂减压蒸发，获得富含维生素K2油脂。
10. 根据权利要求9所述的应用，其特征在于，步骤（III)中，所述的有机溶剂为正己 烷、石油醚、乙醇、异丙醇和乙醚中的任意一种或几种的混合。
【文档编号】C12P7/66GK104328064SQ201410472873
【公开日】2015年2月4日 申请日期:2014年9月16日 优先权日:2014年9月16日
【发明者】黄和, 邱宏伟, 任路静, 王星丽 申请人:丽水双健生物工程有限公司