专利名称：一种芽孢杆菌微生态制剂及其液固结合发酵制备工艺的制作方法
技术领域：
本发明涉及的是一种以枯草芽孢杆菌、地衣芽孢杆菌为主的微生态制剂，还涉及这种微生态制剂的液固结合发酵制备工艺。
背景技术：
微生态制剂是采用有益微生物，经培养、发酵、干燥、加工等工艺制成含有活菌的活菌剂或者包含菌体及其代谢产物的制剂，具有抗病、治病、促生长等功能，而且具有无残留污染，无副作用和不产生抗药性等特点。枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌是微生态制剂的理想菌种，包括在我国农业部公布的可直接饲喂动物的饲料级微生物添加剂中。它们耐酸， 耐碱，耐高温，在制粒过程中及动物胃肠道中均能保持稳定；枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌能分泌蛋白酶、淀粉酶、脂肪酶以及多种氨基酸，从而提高饲料转化率，促进动物生长，缩短饲养周期；并且能促进双歧杆菌、乳酸杆菌和梭菌等厌氧菌的生长，有效抑制肠道中肠杆菌和肠球菌等需氧菌的生长，促进宿主肠道正常菌群生长，维持肠道微生态平衡。传统微生态制剂的制备多采用固态发酵工艺，固态发酵工艺简单，生产成本较低， 但存在产品质量不稳定，发酵过程易污染，干燥过程能耗大等缺点。
发明内容
本发明的目的是针对现有制备芽孢杆菌微生态制剂的技术工艺活菌数不稳定， 易污染杂菌等缺陷，提出一种新的制备芽孢杆菌微生态制剂的工艺方法。该方法采用液固结合制备芽孢杆菌微生态制剂，工艺简单，不易污染杂菌，活菌数稳定，可达IO8个活菌/g 以上。本发明的目的是通过以下技术方案实现的本发明提供一种微生物饲料添加剂及其制备方法。其特征是以液体培养基A，在35 37°C条件下分别培养枯草芽孢杆菌 (Bacillus subtilis)和地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis) 17 M 小时，制成扩培液，菌数达到IOltVmL以上，并按照重量比5 10%与经灭菌后的固体培养基B进行混勻接种，随后在35 37°C条件下进行超短期(广2小时)固体发酵，利用了芽孢杆菌在环境变化时容易产生芽孢的特点，使代谢活跃的菌体在固体培养基中经短期发酵后迅速成熟并生成芽孢。随后进行粉碎、包装，制成微生物饲料添加剂。液体培养基A的组成为1. 0% (m/V)酵母浸粉，1. 6% (m/V)蛋白胨，0. 5% (m/V) NaCl，水，ρΗ6· 0 7· 0。固体培养基B的组成为1. 2% (m/m)葡萄籽提取物，98. 8% (m/m)麸皮。制备步骤如下。出发菌株为枯草芽孢杆菌(Bacillus subtilis)，购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号=CICC 20037 ；地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)购自中国工业微生物菌种保藏管理中心(CICC)，保藏编号CICC 23584。1)一级种子培养一级液体种子培养基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，PH 6. (Γ7. 0，121°C灭菌20min ；培养条件将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种于固体LB培养基平板，37°C培养Mh，挑取单菌落接种于IOmL液体种子培养基，于旋转式摇床 200rpm，37°C培养14 1他，得到一级种子液；
2)二级种子培养二级液体种子培养基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，pH 6. (Γ7. 0，121°C灭菌20min ；培养条件于IL三角瓶中装入200mL 二级液体种子培养基，分别接种上述一级种子液，37°C，200rpm培养，发酵10 1他，得到二级种子液；
3)高密度液体发酵补料液葡萄糖500g/L，蛋白胨200g/L；液体培养基蛋白胨16g/ L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 6. 0 7· 0，121°C灭菌20min ；培养条件于5 50L发酵罐中装入50%体积的液体培养基，接种培养基体积的上述二级种子液，370C，搅拌200rpm 培养6、h后，开始流加补料液，流速50mL/min，发酵至17l4h，停止发酵，得到高密度菌体发酵液；
4)固相载体处理固相培养基(麸皮和质量比的葡萄籽提取物)采用微波干燥杀菌，功率IOkff时间30min，水分含量彡5% ；
5)液固混配将步骤3)中所得的菌体发酵液按照重量比广10%与步骤4)中处理后的固相培养基分别混合，充分拌勻，得到发酵曲；
6)快速固体发酵将步骤5)中所得发酵曲在35 37°C条件下静置广3h，进行快速固体发酵，使菌种成熟并产生芽孢，得到固体发酵产物；
7)粉碎将步骤6)中得到的上述固体发酵产物粉碎，过4(Γ60目筛，经过分袋包装得到成品微生态制剂。步骤1)中固体LB培养基配方蛋白胨16g/L，酵母粉10 g/L, NaCl 5 g/L, pH 6. 0 7· 0，琼脂 15g/L, 121°C 灭菌 20min。步骤3)中液体发酵产物活菌数约为lO^VmL。步骤6)中产品的活菌数约为108/g，芽孢率彡80%。步骤7)中得到的芽孢杆菌微生态制剂以0. 1%的量添加于畜禽类饲料中，用于降
低畜禽腹泻率，提高采食量，提高日增重。本发明所述方法采用液固结合发酵制备工艺，即在液体发酵罐中进行单一菌种高密度发酵，这不仅实现了严格意义上的纯培养，而且活菌数达到IOltVmL以上，然后再进行液体与固体混配，从而制成各种不同规格的液体或固体产品。产品质量稳定可控，能耗大幅下降，生产过程无三废产生，属于清洁生产工艺。
具体实施例方式
下面结合实施例来进一步详细阐述本发明。实施例1 地衣芽孢杆菌微生态制剂的液固结合发酵工艺。将枯草芽孢杆菌(Bacillus subtil is)接种于固体LB培养基平板，37°C培养Mh， 挑取单菌落接种于液体种子培养基(蛋白胨1. 6%，酵母粉1. 0%，NaCl 0. 5%，ρΗ6. (Γ7. 0)，于旋转式摇床200rpm，37°C培养16h，得到一级种子液。于IL三角瓶中装入20%体积的液体种子培养基，分别接种1%上述一级种子液，37°C，200rpm培养，发酵16h，得到二级种子液。于 IOL发酵罐中装入50%体积的液体培养基，接种1%上述二级种子液，370C，搅拌转速200rpm 培养6、h后，开始流加补料液，流速50mL/min，发酵至17l4h，停止发酵。麸皮和质量比 1°Γ2%的葡萄籽提取物采用微波干燥杀菌，功率IOkW时间30min水分含量5%，按照质量比广10%的比例将发酵产物与微波处理后的固体培养基混合，充分拌勻，得到发酵曲，将发酵曲在37°C条件下静置广3h，进行快速固体发酵，使菌种成熟并产生芽孢，得到固体发酵产物。将发酵产物粉碎，过4(Γ60目筛，得到枯草芽孢杆菌微生态制剂。实施例2 枯草芽孢杆菌微生态制剂的液固结合发酵工艺。将地衣芽孢杆菌(Bacillus licheniformis)接种于固体LB培养基平板，37 °C 培养Mh，挑取单菌落接种于液体种子培养基(蛋白胨1. 6%，酵母粉1. 0%，NaCl 0. 5%， ρΗ6. 0 7.0)，于旋转式摇床200rpm，37°C培养16h，得到一级种子液。于IL三角瓶中装入20% 体积的液体种子培养基，分别接种1%上述一级种子液，37°C，200rpm培养，发酵16h，得到二级种子液。于IOL发酵罐中装入50%体积的液体培养基，接种1%上述二级种子液，37°C，搅拌转速200rpm培养6、h后，开始流加补料液，流速50mL/min，发酵至17 24h，停止发酵。麸皮和质量比的葡萄籽提取物采用微波干燥杀菌，功率IOkW时间30min水分含量5%， 按照质量比广10%的比例将发酵产物与微波处理后的固体培养基混合，充分拌勻，得到发酵曲，将发酵曲在37°C条件下静置广3h，进行快速固体发酵，使菌种成熟并产生芽孢，得到固体发酵产物。将发酵产物粉碎，过40飞0目筛，得到地衣芽孢杆菌微生态制剂。
权利要求
1.一种微生态制剂，由枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌活菌分别与固体载体组成。
2.根据权利要求1所述的一种微生态制剂，其特征在于使用的固体培养基中含有麸皮和(质量比)的葡萄籽提取物。
3.根据权利要求1所述微生态制剂，其制备方法包括以下步骤1)一级种子培养一级液体种子培养基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L， PH 6. (Γ7. 0，121°C灭菌20min ；培养条件将枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌分别接种于固体LB培养基平板，37°C培养Mh，挑取单菌落接种于IOml液体种子培养基，于旋转式摇床 200rpm，37°C培养14 1他，得到一级种子液；2)二级种子培养二级液体种子培养基蛋白胨16g/L，酵母粉10g/L，NaCl 5g/L，pH 6. (Γ7. 0，121°C灭菌20min ；培养条件于IL三角瓶中装入200ml 二级液体种子培养基，分别接种上述一级种子液，37°C，200rpm培养，发酵10 1他，得到二级种子液；3)高密度液体发酵补料液葡萄糖500g/L，蛋白胨200g/L；液体培养基蛋白胨16g/ L，酵母粉10 g/L，NaCl 5 g/L，pH 6. 0 7· 0，121°C灭菌20min ；培养条件于5 50L发酵罐中装入50%体积的液体培养基，接种培养基体积的上述二级种子液，370C，搅拌200rpm 培养6、h后，开始流加补料液，流速50ml/min，发酵至17 24h，停止发酵，得到高密度菌体发酵液；4)固相载体处理固相培养基(麸皮和质量比的葡萄籽提取物)采用微波干燥杀菌，功率IOkff时间30min，水分含量彡5% ；5)液固混配将步骤3)中所得的菌体发酵液按照重量比广10%与步骤4)中处理后的固相培养基分别混合，充分拌勻，得到发酵曲；6)快速固体发酵将步骤5)中所得发酵曲在35 37°C条件下静置广3h，进行快速固体发酵，使菌种成熟并产生芽孢，得到固体发酵产物；7)粉碎将步骤6)中得到的上述固体发酵产物粉碎，过4(Γ60目筛，经过分袋包装得到成品微生态制剂。
4.根据权利要求3所述微生态制剂的制备方法，其特征在于使用液体培养基高密度发酵枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌后，按照重量比广10%分别与经灭菌后的固体培养基进行混勻接种，随后在35 37°C条件下进行超短期(广3小时)固体发酵。
全文摘要
本发明提供一种微生物饲料添加剂及其制备方法。主要工艺过程是以液体培养基在35~37℃条件下分别培养枯草芽孢杆菌和地衣芽孢杆菌17~24小时，与经灭菌后的含有麸皮和葡萄籽提取物的固体培养基进行混匀接种，随后在35~37℃条件下进行短期(1~3小时)固体发酵，利用芽孢杆菌在环境变化时容易产生芽孢的特点，使代谢活跃的菌体经短期固体发酵后迅速成熟并生成芽孢。随后进行粉碎、包装，制成微生物饲料添加剂，有效菌数≥1×108CFU/g，以0.1%的量添加于畜禽类饲料中，用于降低畜禽腹泻率，降低染病率，提高采食量，提高日增重。
文档编号C12R1/125GK102409007SQ201110184359
公开日2012年4月11日 申请日期2011年7月4日 优先权日2011年7月4日
发明者刘晋生, 刘阳, 吴雅倩, 孙骏跃, 宋诙, 徐健勇, 李丽, 谭明, 郑雯 申请人:天津工业生物技术研究所, 天津市育琪生物技术有限公司