道地黄芪固氮菌新菌株t21及发酵液的制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及植物固氮细菌的利用领域，具体地说是涉及一种道地中药黄芪固氮菌 t21及发酵液的制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，全球种植业过分依赖和大量施用化肥造成的肥料浪费、土壤和地下水污 染以及生态失衡已经引起了世界各国的广泛关注。减少化肥的使用、提高氮肥利用率是当 前农业生产中急需解决的重要问题。充分发挥固氮细菌的生物固氮作用是减少氮肥使用量 最有效的途径，生物固氮资源的研宄、开发和利用在我国农业可持续发展中占有重要地位。 生物固氮是自然界中仅次于光合作用的复杂生物反应系统，为全球的植物提供了大约75% 的氮素。生物固氮在提高土壤肥力、增强植物抗病能力等方面也发挥着极其重要的作用。
[0003] 固氮细菌根据其生活习性可分为自身固氮菌、联合固氮菌和共生固氮菌三类。自 身固氮菌是指在自由生活状态下能够固氮的细菌，其种类不多，分布很广，如圆褐固氮菌和 拜叶林克氏固氮菌。联合固氮菌是指定植于植物根表和近根土壤中，有的能侵入表皮和外 皮层的细胞间隙，靠根系分泌物生存、繁衍，与植物根系有密切的关系的固氮细菌，如雀稗 固氮菌和产脂固氮螺菌。共生固氮菌的细菌只有根瘤菌一类，其广泛存在于土壤中，浸染豆 科植物根部形成根瘤，能将空气中的氮气转化为氨提供给植物。上述三类固氮菌中，自身固 氮菌由于其固氮效率低，且固氮特殊，不适合在农业方面广泛应用，所以目前农业方面主要 应用联合固氮菌和共生固氮菌。
[0004] 黄苗Bunge)是豆科黄苗属多年生草本植物，又名绵 芪。在我国产于内蒙古、山西、甘肃、黑龙江等地。黄芪具有增强机体免疫功能、保肝、利尿、 抗衰老、抗应激、降压和较广泛的抗菌作用，作为药用已有2000多年的历史。由于长期大 量采挖，近几年来野生黄芪的数量急剧减少，有趋于绝灭的危险。在黄芪种植过程中，各项 农资投入中化肥尤其是氮肥所占比重很大，其对黄芪的产量和活性成分聚集的影响也最显 著。而黄芪作为豆科植物，其根际土壤中也共生有大量固氮菌，发挥着重要的固氮作用。山 西浑源县是中药材黄芪的产地。得益于当地水土，浑源所产黄芪甲甙、多糖等含量均为国内 之首，并于2011年获批国家地理标志证明商标"正北芪"。根据浑源道地黄芪的正宗药用性 和原产地有用成份这一地理标识产物，以其原生地土壤根瘤菌为研宄基础，对道地黄芪的 固氮根瘤菌进行分离，筛选和鉴定，并对其培养条件和生理生化以及生物信息学方面进行 研宄。该研宄为利用生物固氮在黄芪生产上实现节肥减耗、加强黄芪种植业生态系统的良 性循环提供科学基础和技术支持。
【发明内容】
本发明的目的是提供一株道地黄芪固氮菌t21及发酵液的制备方法，该发酵液具有非 常明显的固氮作用。
[0005] 本发明的技术方案如下： 一株道地黄苗固氮菌（5'//?〇_/^办〇/^'?7?8口.九21菌株于2014年9月18日保藏于中国微 生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，分类命名为中华根瘤菌（sp.)， 保藏号为CGMCC No. 9677,地址：北京市朝阳区北辰西路1号院3号中国科学院微生物研 宄所。
[0006] 所述的道地黄苗固氮菌（sp.)新菌株t21是从山西省浑源地区的 黄芪生长土壤为材料分离得到的根瘤细菌。
[0007] 将道地黄芪固氮菌新菌株t21在Ashby无氮培养基培养，菌落形态呈圆形，无色透 明（见图1)。在YMA固体培养基上（由YMA液体培养基添加1. 5%琼脂制成培养平板）生长 较快，菌落成粘稠状易流动。革兰氏染色，显示新菌株t21为革兰氏阴性杆菌，无芽孢(见图 2);苏丹黑B染色呈阳性，可见菌体内有黑色着色点，为菌体内的PHB颗粒（见图3);孔雀 绿染色呈阴性，提示B图中的着色点不是细胞内芽胞所致（见图4)。根据《常见细菌系统 鉴定手册》对菌株t21进行了生理生化鉴定，其特征见表1。
[0008] 表1菌株t21的生理生化特征
【主权项】
1. 一株道地黄苗固氮菌（sp.)新菌株t21于2014年9月18日保藏于 中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No. 9677。
2. 根据权利要求1所述的道地黄苗固氮菌（sp.)新菌株t21，其特征 在于，道地黄苗固氮菌sp.)新菌株t21是从山西省大同市浑源县黄苗基 地土壤中分离得到的细菌；将道地黄苗固氮菌（SiflorAizoAiw? sp. H21在YMA培养基上生 长较快，菌成粘稠状易流动，革兰氏阴性，菌体呈短杆状，无芽孢，有PHB颗粒；根据《常见细 菌系统鉴定手册》对菌株t21进行了生理生化鉴定，结果如下表所示： 本发明新菌株t21的生理生化特征
注：+表示呈阳性反应；一表示呈阴性反应. 提取新菌株t21的DNA，经PCR反应扩增其16S rRNA序列，测序后获得序列1309bp， 将其序列在 NCBI 网站 Blast 比对，t21 菌株与 sp. SCAUS141 的 16S rRNA 基因序列同源性为99% (KF836038)，结合形态观察及生理生化试验，确定新菌株t21为 Sinorhizobium sp. 〇
3. 根据权利要求1所述的道地黄芪固氮菌新菌株t21，其发酵液的制备方法包括如下 步骤： (1) 种子液制备从试管斜面上用接种针挑取菌株t21到斜面培养基上，恒温28°C培 养24h后接种到装有IOOmL的LB培养液的三角瓶中，180r/min振荡培养12h，制得道地黄 芪固氮菌新菌株t21的种子液； (2) 发酵液制备将解淀粉芽孢杆菌新菌株t21的种子液按照1%的比例接入发酵培养 基，培养条件是：28°C、初始pH为6. 8~7. 0、摇床转速180 - 200r/min震荡培养30h，制得 道地黄芪新菌株t21的发酵液。
4. 根据权利要求3所述的道地黄芪固氮菌新菌株t21发酵液的制备方法，其特征在于， 所述的发酵培养基是由下列质量/体积份的原料组成：YM液体培养基：甘露醇14份，酵母 粉 5 份，MgSO4 · 7H20 0· 1 份，K2HPO4 0· 3-0. 4 份，NaCl 0· 3-0. 4 份，CaCl2 0· 01 份，H2O 1000份，所配得的培养基pH 6. 8~7. 0。
5.根据权利要求1所述的道地黄芪固氮菌新菌株t21的使用的方法是：将含菌浓度为 IO8Inr1的发酵液浸种3h后播种。
【专利摘要】本发明公开了一株道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21，于2014年9月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心，保藏号为CGMCC No.9677。本发明详细描述了道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的形态特征、生理生化指标及16S rDNA序列测定结果等。经固氮试验表明，本发明道地黄芪固氮菌（Sinorhizobium sp.）新菌株t21的发酵液对道地黄芪有较好的固氮作用，可以有效地为道地黄芪生长提供天然氮源需要，从而对道地黄芪的天然品质提供相应的营养来源。CGMCC No.967720140918
【IPC分类】C12R1-01, C12N1-20, C05F11-08
【公开号】CN104726365
【申请号】CN201510024917
【发明人】唐中伟, 梁建萍, 周然, 薛智权, 李 浩, 李倩
【申请人】山西农业大学, 山西中医学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年1月19日