酿酒酵母孢子表达的(s)-羰基还原酶ii不对称转化制备(s)-苯乙二醇的方法
【技术领域】
[0001]利用酿酒酵母孢子中表达的(5)-羰基还原酶II不对称转化制备(5)-苯乙二醇的方法，本发明涉及基因工程技术使酶在酿酒酵母中表达，通过限制培养条件诱导其产生孢子将(5)-羰基还原酶II进行包埋，形成活性孢子。利用酵母孢子天然的抗逆性有效提升(5)-羰基还原酶II的耐逆性，高效制备(5)-苯乙二醇，属于生物催化不对称转化技术领域。
【背景技术】
[0002]手性化合物在医药、农药、激素、食品添加剂等精细化工行业中应用广泛，如光学纯(5)-苯乙二醇不仅是制备具有光学活性的医药、农药和功能材料的重要中间体，也是液晶材料中不可缺少的重要手性添加剂。
[0003]氧化还原酶能用于不对称催化转化手性化合物的制备，但其催化活性受环境影响较大，仅在特定温度和PH条件下进行稳定的生物转化，无法适应工业生产中多变的反应环境；同时，现阶段研宄多采用大肠杆菌作为表达系统，该系统存在一些致命弱点，如菌种安全性和蛋白翻译后无法修饰等，限制了其工业应用的潜力。
[0004]与大肠杆菌相比，酿酒酵母是一种安全的、具有完整蛋白后修饰功能的基因表达宿主。更加特别的是，酿酒酵母细胞在营养匮乏时产生网状膜结构的子囊孢子，可以拦截酶等外源大分子，而且能抵御外界不良环境，能为孢子内的重组酶提供一个优良的催化内环境，是一种极具潜力的酶表达宿主。
[0005]本实验室已经利用(5)-羰基还原酶II的重组大肠杆菌不对称转化制备(5)-苯乙二醇，在此基础上，将来源于近平滑假丝酵母(Candida parapsi1sis) CCTCC NO:M203011的(5)-羰基还原酶II基因克隆至酿酒酵母AN120中，实现酶的异源表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质诱导培养重组酵母，产生含有(5)-羰基还原酶II的重组活性孢子。以重组孢子为生物催化剂，2-羟基苯乙酮为底物进行生物转化，重组孢子对不良环境具有很好的耐受性，连续使用20次后仍能保持85%以上的转化效率，实现了重组孢子在多变环境下高效制备(5)-苯乙二醇。
【发明内容】
[0006]( I)要解决的技术问题
本发明的目的是提供一种基因工程技术实现酶在酿酒酵母中的异源表达，利用重组菌株(菌种保藏号:CCTCC NO:M2015100)不对称转化制备(5)-苯乙二醇的方法。本发明目的在于将来源于近平滑假丝酵母iC.parapsilosis)中的(5)-羰基还原酶II基因克隆至酿酒酵母AN120中表达，通过加入醋酸钾作为唯一能源物质培养菌体，诱导其产生孢子将(5)-羰基还原酶II进行包埋，形成活性孢子。该活性孢子不对称还原2-羟基苯乙酮制备光学活性(5)-苯乙二醇，连续使用20批次后，产物光学纯度高达99%，转化率高于85%。解决了(5)-羰基还原酶II对环境耐受性差的问题，显著提升了酶的催化稳定性和使用批次性，为工业上高效、低成本制备光学纯(5)-苯乙二醇奠定了坚实的基础。
[0007](2)技术方案:一株产生用于不对称转化制备(5)-苯乙二醇的重组活性孢子的重组酿酒酵母，其分类命名为酿酒酵母(S.ceri?Fi5'iai?)AN120/pRS424-TEFpr-5'crII,已保藏于中国典型培养物保藏中心，保藏编号:CCTCC NO:M2015100o
[0008]利用所述的重组酿酒酵母所产的重组活性孢子不对称转化制备(5)-苯乙二醇的方法，将(5)-羰基还原酶通过构建重组质粒pRSAZ^TEFpr-scrll转入酿酒酵母AN120中，得到重组酿酒酵母ANUO/pRSAZfTEFpr-scrll，利用培养得到含有目标酶的重组活性孢子，以2-羟基苯乙酮为底物，催化不对称转化反应:在I mL 0.1 mo I/L pH5.0~5.5醋酸缓冲液，或 I mL 0.1 mol/L pH 6.0~7.5 磷酸缓冲液，或 I mL 0.1 mol/L pH 8.0-9.0Tris-HCl缓冲液中，重组活性孢子浓度为0.1 g/mL，2-羟基苯乙酮底物浓度为6 g/L，与2-羟基苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，反应温度40°C，反应时间4 h。
[0009]重组活性孢子的获得:
Yro液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；固体培养基添加15琼脂粉；
YPACE液体培养基以g/L计:KAc 20，胰蛋白胨20，酵母提取物10，以去离子水配制； 产孢培养基以g/L计:KAc 20，，以去离子水配制；
培养条件:挑取重组酿酒酵母S.cerevisiae ANl20/ pRS424-TEFpr-5crII的单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养16 h ;取10 mL培养液转接于I L的YPACE液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养24 h后，6000 rpmUO min无菌离心收集菌体，并转入IL产孢培养基中继续培养2 - 3 d，用显微镜镜检产孢效率，产孢完成后，6000 rpmUO min离心收集菌体并以少量pH 6.0磷酸缓冲液重悬菌体，以超声细胞破碎仪处理I h，工作强度50%、工作时间I S、工作间隙3 S，离心收集重组活性孢子待用。
[0010]重组酿酒酵母S.cerevisiae ANl20/ pRS424-TEFpr-5crII 的构建:
YPD液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制；SD-Trp培养基以g/L计:葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，以去离子水配制；固体培养基添加20琼脂粉；
培养条件:挑取酿酒酵母AN12 O单菌落接种于5 mL的YI3D液体培养基中，3 O °C、200rpm震荡培养16 h，取I mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μ L组成为 IM DTT 10 yL、50% PEG 80 yL、2M LiAc 10 μ L 的 Buffer 重悬菌体，加入重组质粒pRS424-TEFpr-5crII I μ L，轻轻混匀后于45°C温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30°C倒置培养。
[0011]重组质粒ρΚ5424-ΤΕΡρ;τ-5.??_τΠ 的构建:
利用限制性内切酶I和沿ο I，目的基因scrll与载体pRS424-TEFpr分别进行双酶切处理，处理后DNA片断通过粘性末端连接，获得重组质粒pRSAZ^TEFpr-scrll。
[0012]scrll基因的获得
以近平滑假丝酵母基因组为PCR反应模板，利用含有I和通ο I限制性酶切位点的引物 SCR_F，SCR_R:
SCR_F:5’ -TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3’，SCR_R:5’ -CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3’ ；
PCR反应体系:ddH20 37 μ L，10 X React1n Buffer 5 uL,25 mmol/L dNTP 0.5 μ L，50 pmol/yL 的引物 SCR_F 和 SCR_R 各 I μ L，基因组 DNA 5 yL，5 U/μ L 的 Taq DNApolymerase 0.5 μ L；
PCR反应过程:94°C 预变性5 min ；94°C I min,60 °C 30 s、72°C I min，进行30个循环；72°C延伸 10 min。
[0013]用于获得scrll基因所需要提取的近平滑假丝酵母基因组的菌种为近平滑假丝酵母 iC.parapsilosis) CCTCC NO:M203011。
[0014]一、基因组的获得
近平滑假丝酵母ic.parapsilosis) CCTCC NO:M203011的培养基组成为:葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
[0015]将近平滑假丝酵母接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30°C、200 rpm振荡培养16 h。培养结束后，将菌体于6，000 rpm、20min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组 DNA 提取试剂盒 Genomic DNA Extract1n Miniprep SystemCV1GENE公司)提取基因组。
[0016]二、scrll基因的获得合成两端引物(下划线为酶切位点):
SCR F:5，-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3>(Pst
I)，
SCR_R:5， -CCGCTCGAGC TATGGACAAG T