0次后，其催化产物的光学纯度几乎不变，得率仍维持在85%以上。这些工作很好地克服了羰基还原酶对环境耐受性较差的限制，首次实现了氧化还原酶在酵母孢子内的异源表达，为手性化合物的高效制备奠定了坚实的研宄基础。
[0037]生物材料样品保藏:酿酒酵母SscchaxomycGS.cerevisiae ANl20/pRSAZfTEFpr-scrll，保藏单位:中国典型培养物保藏中心，简称CCTCC，地址:中国武汉武汉大学，保藏编号:CCTCC NO:M2015100o保藏日期2015年3月11日。
【具体实施方式】
[0038]实施例1
近平滑假丝酵母{C.parapsilosis) CCTCC NO:M203011的菌体培养，其培养基组成为:葡萄糖2%，酵母膏1%，胰蛋白胨2%。
[0039]将酵母接种于培养基装液量为20%的250 mL摇瓶中于30°C、200 rpm振荡培养16h0
[0040]实施例2
近平滑假丝酵母(C parapsilosis) CCTCC NO:M203011基因组的提取:将实施例1培养的菌体于6，000 rpm、20min下离心，用生理盐水洗涤两次后收集细胞，利用基因组DNA提取试剂盒 Genomic DNA Extract1n Miniprep System (V10GENE 公司)提取基因组。
[0041]实施例3
scrll基因获得:引物:
SCR F:5，-TGCACTGCAG ATGCACCACC ACCACCACCA CGGCGAAATC GAATCTTATT GCA-3>(Pst
I);
SCR_R:5， -CCGCTCGAGC TATGGACAAG TGT-3? {Xho I)。
[0042]采用PCR 反应体系:ddH20 37 μ L，10 X React1n Buffer 5 μ L，dNTP (25 mmol/L) 0.5 μ L，引物(50 pmol/ μ L)各 I μ L，基因组DNA 5 μ L, Taq DNA polymerase (5 U/μ L) 0.5 μ L0
[0043]PCR 反应:94°C 预变性 5 min ；94°C I min，60°C 30 s，72°C I min，进行 30 个循环；72°C延伸10 min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，以引物SCR_F和SCR_R进行PCR反应，获得《scrll 基因片段。利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purificat1n Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
[0044]实施例4
pRS424-TEFpr-5crII重组质粒的获得:基因及质粒pRS424_TEFpr的酶切反应体系:10 X Buffer H 4 μ L，DNA 10 μ L，Pst I 2 μ L，Xhol 2 μ L，ddH20 将体系补足 40ULo 37°C水浴3 h，在管中加入1/10 (v/v)的Loading Buffer或将管置于65°C保温10min，终止酶切反应。酶切产物经琼脂糖凝胶电泳分析并切胶回收并浓缩。采用以下连接反应体系:质粒 pRS424_TEFpr 0.8 μ L，基因 scrIM.2 μ L, Ligat1n Solut1n 5 yL，将混合连接液置于16°C培养箱中连接12-16 ho
[0045]在每管100 E.co7i JM109感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42°C水浴中，热击90 S。快速转移至冰浴冷却3 min。每管中加入800 uL LB液体培养基，37°C 150 rpm摇床温育培养I h。培养后菌液4，000 rpm离心2 min,弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。
[0046]挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养12 h，利用质粒提取试剂盒Min1-Plasmid Rapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证=1XBuffer H 2 μ L，质粒DNA 5 yL, Pst I 0.5 μ L, Xhol 0.5 μ L，ddH20将体系补足20 yL。获得阳性质粒pRS424-TEFpr_6^rI I。
[0047]实施例5
重组酿酒酵母 S.cerevisiae AN120/pRS424-TEFpr-5crII 的获得:YPD 培养基以 g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。SD-Trp培养基以g/L计:葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，需用固体培养基可加入20琼脂粉。挑取酿酒酵母AN120接种于5mL的YI3D液体培养基中，30°C、200rpm震荡培养16 h，取I mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用 100 μ L Buffer (IM DTT 10 μ L, 50% PEG 80 yL，2M LiAc 10 yL)重悬菌体，加入重组质粒pRSAZfTEFpr-scrll I μ L，轻轻混匀后于45°C温浴30 min，取出后将菌液涂布SD-Trp平板，于30°C恒温培养箱中倒置培养2 - 3 d获得重组菌单菌落。
[0048]实施例6
重组酵母孢子的培育:YPD培养基组分同实施例5，YPACE培养基以g/L计:KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。产孢培养基以g/L计:KAc 20。
[0049]挑取重组酿酒酵母ANUO/pRSAZA-TEFpr-scrll单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于I L的YPACE液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养24 h。6000 rpm、1min无菌离心收集菌体，用产孢培养基重悬菌体，转移到I L的产孢培养基中继续培养2-3 d，期间取样并用显微镜镜检产孢率。待产孢完全后，6000 rpmUO min离心收集菌体，用少量PBS (pH 6.0)重悬，经过超声破碎处理即可将孢子从酵母细胞中释放出来待用。
[0050]实施例7
在I mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 5.0)中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40°C恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(5)-苯乙二醇的光学纯度为90.2% e.e.，产率为69.Tl。
[0051]实施例8
在I mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40°C恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(5)-苯乙二醇的光学纯度为99.3% e.e.，产率为99.0%。
[0052]实施例9
在I mL 0.1 mol/L醋酸缓冲液(pH 5.5)中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40°C恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(5)-苯乙二醇的光学纯度为97.1% e.e.，产率为92.8%。
[0053]实施例10
在I mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0)中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40°C恒温摇床上振荡反应4ho反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(5)-苯乙二醇的光学纯度为91.3%e.e.，产率为 78.1%。
[0054]实施例11
在I mL 0.1 mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 9.0)中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在40°C恒温摇床上振荡反应4ho反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(5)-苯乙二醇的光学纯度为90.2% e.e.，产率为 71.3% ο
[0055]实施例12
在I mL 0.1 mol/L磷酸缓冲液(pH 6.0)中，分别加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮及等摩尔量辅酶NADPH，0.1 g/mL重组孢子湿菌体，混匀后在20°C恒温摇床上振荡反应4 h。反应后混合物离心，取上清液萃取，产物(5)-苯乙二醇的光学纯度为97.4% e.e.，产率为60.Tl。
[0056]实施例13<