一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株及生产巴卡亭Ⅲ的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于生物技术领域，公开了一组高产巴卡亭III组合菌株及生产巴卡亭III的 方法。
【背景技术】
[0002] 癌症是严重影响人类健康的重大疾病之一，1979年美国癌症中心（National Cancer Institute)证实紫杉醇具有独特的抗癌机理。紫杉醇对卵巢癌、乳腺癌、肺癌、食管 癌、黑色素瘤、头颈部癌具有很好的疗效。但是，天然紫杉醇主要来源于红豆杉属（Taxus) 植株，含量很低，制备一例病人所需药物要用3-4棵百年红豆杉大树，而从大约2000棵红豆 杉大树树皮中只能提取Ikg紫杉醇。而红豆杉属（Taxus)植物为我国珍稀濒危物种，属国 家一级保护植物。
[0003] 紫杉醇细胞培养、真菌发酵、全合成与半合成等研宄报道很多。其中细胞培养生产 紫杉醇不失为一种较理想的方法，但是其产率较低。
[0004] 自从1991年Stierle与Stroble筛选出第一株产紫杉醇的内生真菌以来，国内外 学者相继开展了筛选产紫杉醇内生真菌的研宄。例如，马天有等分离得到一株能产紫杉醇 的内生真菌，产量为141. 20 μ g/L(马天有，董兆麟.从植物分离产紫杉醇的内生真菌的研 宄.西北大学学报：自然科学版，1999. 2(91):47-49);胡凯等分离到三株紫杉醇产生菌， 最高一株产量为276. 75 μ g/L(胡凯，谈峰，唐克轩，等.南方红豆杉中产紫杉醇内生真菌的 分离和筛选.西南师范大学学报.自然科学版，2006. 31(1): 134-137)。孟丽等从根部不 仅分离到产紫杉醇的多个内生真菌菌株，而且其中一株镰刀菌（Fusarium sp.)菌株产量 高达515. 20 μ g/L(竺俊鑫；李勇超；孟丽；红豆杉中产紫杉醇内生真菌分离部位的比较研 宄[J];生物技术通报；2008年04期），为迄今报道的产紫杉醇内生真菌产量最高的野生菌 株。综观以往研宄，产紫杉醇菌株的产率总体较低，仍达不到真菌发酵工业化生产紫杉醇的 盈亏平衡点（lmg/L)。
[0005] 1988年，法国Denis等首次报道了以10-去乙酰巴卡亭 III (l〇-deacetylbaccatinIII，l〇-DAB)为原料半合成紫杉醇。1994年美国施贵宝公司（BMS) 采用Holton教授半合成方法的专利生产半合成紫杉醇。1997年，半合成紫杉醇通过美国 FDA批准上市。半合成紫杉醇是当前生产紫杉醇的主要途径，其是以红豆杉树皮中含量相 对较丰富的10-DAB为起始母核，首先用硅烷基团保护7位羟基，再乙酰化10位羟基，形成 TES-baccatin III，其再与C13侧链前体缩合，然后水解除去7位和2位上的保护基团即成为 紫杉醇。但是紫杉醇转化的前体物一一10-DAB主要是从红豆杉树皮或枝叶中获得，因此， 紫杉醇的生产还脱离不了红豆杉资源。
[0006] 巴卡亭III (Baccatin III)是红豆杉中生物合成紫杉醇的中间产物，其结构比 10-DAB在10位上多了一个乙酰基，更接近紫杉醇。故而巴卡亭III比10-DAB更具市场前景。
【发明内容】
[0007] 本方法的目的在于提供一组高产巴卡亭III组合菌株及该组合菌株生产巴卡亭III 的方法，通过培养该组合菌株发酵液中的巴卡亭III含量大幅提高，为半合成法生产紫杉醇 提供优质价廉的前体物质。
[0008] 本发明的目的通过下述技术方案实现：
[0009] 一组高产巴卡亭III组合菌株为产巴卡亭III菌株与产紫杉醇菌株的组合菌株。
[0010] 优选的，所述的产巴卡亭III菌株为南方红豆杉内生真菌no. 79 ;所述的产紫杉醇 菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58或印度紫杉内生Gliocladium sp.。其中，南方红豆杉内 生真菌no. 79在文献1中公开，曼地亚红豆杉内生真菌Z58在文献2中公开，印度紫杉内生 Gliocladium sp.在文献3中公开。
[0011] 文献 I ：Jian Zaiyou, Meng Li, Xu Guifang, Zhou Xiuren. Isolation of an endophytic fungus producing baccatin III from Taxus wallichiana var. mairei. J Ind Microbiol Biotechnol, 2013. 40:1297-1302.该文献记载了从南方红豆杉中分离到一 株产巴卡亭III的内生菌菌株no. 79 (Diaporthe sp.)，其巴卡亭III产量是0· 219mg/L。
[0012] 文献2 :苗莉云，张鹏，刘博，徐曼，等.产紫杉醇内生真菌Z58的分离和鉴定.中 国生物化学与分子生物学报，2012. 28(12): 1141-1146。该文献记载了从曼地亚红豆杉中分 离得到一株产紫杉醇内生真菌菌株Z58 (Hypocrea sp.)，其紫杉醇产量为2. 5-3. 0 μ g/g。
[0013] 文献 3:D. Sreekanth，A. Syed，S. Sarkar，D. Sarkar，et al. Production, purification, and characterization of taxol and 10-DABI11 from a new endophytic fungus Gliocladium sp. isolated from the Indian yew tree, Taxus baccata. J Microbiol Biotechnol, 2009. 19(11)，1342-1347.该文献记载了从印度紫衫中 提取了一株产紫杉醇和10-去乙酰巴卡亭III的内生菌新菌株（Gliocladium sp.)，其紫杉 醇和10-去乙酰巴卡亭III产量分别为10 μ g/L和65 μ g/L。
[0014] 真菌no. 79、Z58和Gliocladium sp.菌株的分类如下：
[0015] no. 79为真菌界，子囊菌纲，球壳目，腐皮壳科，间座壳属。
[0016] Z58为真菌界，粪壳菌纲，肉座菌目，肉座菌科，肉坐菌属。
[0017] Gliocladium sp.为真菌界，粪壳菌纲，肉座菌目，肉座菌科，粘帚霉属。
[0018] no. 79、Z58 和 Gliocladium sp.的特征见下表。
[0019]
【主权项】
1. 一组高产巴卡亭III组合菌株，其特征在于：为产巴卡亭III菌株与产紫杉醇菌株的组 合菌株。
2. 根据权利要求1所述的高产巴卡亭III组合菌株，其特征在于：所述的产巴卡亭III菌 株为南方红豆杉内生真菌no. 79 ;所述的产紫杉醇菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58或印 度紫杉内生Gliocladiumsp.〇
3. 权利要求1或2所述的高产巴卡亭III组合菌株在生产巴卡亭III中的应用。
4. 权利要求1或2所述的高产巴卡亭III组合菌株生产巴卡亭III的方法，其特征在于： 为产巴卡亭III菌株与产紫杉醇菌株混合培养。
5. 根据权利要求4所述的生产巴卡亭III的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将产巴卡亭III菌株，产紫杉醇菌株分别接种于PDA培养基中培养得到种子发酵液； (2) 将产巴卡亭III菌株的种子发酵液，产紫杉醇菌株的种子发酵液分别接种于发酵培 养基中扩大培养； (3) 将扩大培养的产巴卡亭III菌株菌液与产紫杉醇菌株菌液混合，再补加发酵培养基 培养； (4) 巴卡亭III的提取：将（3)培养得到的发酵液离心，上清液用二氯甲烷萃取，菌丝破 碎后也用二氯甲烷萃取，合并二氯甲烷萃取液，通过干燥、蒸干得到巴卡亭III。
6. 根据权利要求5所述的生产巴卡亭III的方法，其特征在于：步骤（2)中所述的发酵 培养基为：马铃薯200g、麸皮10g、酵母膏lg/L、蔗糖20g、苯甲酸钠250mg/L、硫酸镁0. 4g/ U磷酸二氢钾2g/L、水1000 mL;或马铃薯200g，麸皮5g，酵母膏lg/L，蔗糖20g，硫酸镁2g/ L，苯甲酸钠250mg/L，硫酸锌0.05g/L，钼酸铵0? 15g/L，水1000 mL;自然pH。
7. 根据权利要求5所述的生产巴卡亭III的方法，其特征在于包括如下步骤： (1) 将产巴卡亭III菌株，产紫杉醇菌株分别接种于60mLPDA培养基中培养得到种子发 酵液； (2) 菌体生长培养：将产巴卡亭III菌株的种子发酵液，产紫杉醇菌株的种子发酵液分 别接种于含500mL发酵培养基的摇瓶中培养得到含菌体和培养液的菌液； (3) 将产巴卡亭III菌株菌液与产紫杉醇菌株菌液按体积比1:1混合，再补加总体积1倍 的发酵培养基培养； (4) 巴卡亭III的提取：将（3)培养得到的发酵液4000rpm离心15min，上清液部分用等 体积的二氯甲烷萃取，取水相部分再用等体积的二氯甲烷萃取1次；菌丝部分经液氮研碎， 超声30min，静置过夜后用等体积的二氯甲烷萃取，重复处理1次；将所有的二氯甲烷萃取 液合并，加入无水硫酸钠干燥，过滤后用旋转蒸发器在35°C下减压蒸馏至干得到巴卡亭III。
8. 根据权利要求5-7任一项所述的生产巴卡亭III的方法，其特征在于还包括含量检测 步骤：将得到的巴卡亭III用甲醇溶解，滤膜过滤后上高效液相色谱柱，色谱条件为：VP-〇DS C18柱；流动相为甲醇：水：乙腈=20 : 45 : 35;流速0. 7mL/min，检测波长227nm。
【专利摘要】本发明公开了一组高产巴卡亭Ⅲ组合菌株及生产巴卡亭Ⅲ的方法，属于生物技术领域。高产巴卡亭Ⅲ组合菌株为产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株的组合菌株，产巴卡亭Ⅲ菌株为南方红豆杉内生真菌no.79，产紫杉醇菌株为曼地亚红豆杉内生真菌Z58或印度紫杉内生Gliocladium sp。通过将产巴卡亭Ⅲ菌株与产紫杉醇菌株单独培养后再混合培养，大幅提高了发酵物中巴卡亭Ⅲ的产量。本发明利用代谢途径互补和反馈抑制原理大大提高了巴卡亭Ⅲ的产量，远高于单独培养的产量。本发明使利用内生真菌进行工业发酵培养生产巴卡亭Ⅲ成为可能，为半合成法生产紫杉醇提供更为廉价的原料，降低了生产成本；减弱对红豆杉资源的依赖，减小对环境的破坏。
【IPC分类】C12P17-02, C12N1-14
【公开号】CN104726345
【申请号】CN201510066440
【发明人】李勇超, 周修任, 杨靖, 简在友, 孟丽
【申请人】河南科技学院
【公开日】2015年6月24日
【申请日】2015年2月7日