GT-3? {Xho I)；
具体方法如下:
PCR 反应体系:ddH20 37 μ L，10 X React1n Buffer 5 μ L，dNTP (25 mmol/L) 0.5yL，引物 SCIU^PSCR_R (50 pmol/yL)各 I yL，基因组 DNA 5 μ L，Taq DNA polymerase(5 U/yL) 0.5 μ L0
[0017]PCR 反应:94°C 预变性 5 min ；94°C I min，60°C 30 s，72°C I min，进行 30 个循环；72°C延伸10 min。以近平滑假丝酵母基因组为模板，以引物SCR_F和SCR_R进行PCR反应，获得 scrll 全长片段。利用 3S Spin Agarose Gel DNA Purificat1n Kit (上海申能博彩生物科技有限公司)纯化DNA片断。
[0018]三、含_scrll基因的重组质粒ρΚ3424-ΤΕΡρΓ-.5^τΠ的构建基因及质粒pRS424_TEFpr的酶切
利用质粒提取试剂盒Min1-Plasmid Rapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒pRS424-TEFpr。
[0019]按照水、缓冲液、基因或质粒DNA、酶的顺序加到Eppendorf管中，盖好管盖，振荡使液体充分混匀，置于离心机内离心2 s使液体集中于管底，37°C水浴3 h，在管中加入1/10的Loading Buffer或将管置于65°C保温10 min，终止酶切反应。酶切产物进行琼脂糖凝胶电泳分析，切胶回收并浓缩。
[0020]反应体系组成:10X Buffer H 4 μ L，DNA 10 μ L, Pst I 2 μ L, Xhol 2 μ L，ddH20将体系补足40 μ L0
[0021]基因《scrll与质粒pRS424_TEFpr的连接反应体系组成如下:质粒 pRS424_TEFpr 0.8 μ L，基因 scrIM.2 μ L，Ligat1nSolut1n 5 μ L，将混合连接液置于16°C培养箱中连接12-16 h。
[0022]重组质粒转化大肠杆菌E.coli JM109
在每管的100 μ LA.co7i JM109感受态细胞悬液中加入10 μ L连接产物，轻轻混匀，冰浴中静置40 min。转入42°C水浴中，热击90 S。快速转移至冰浴中冷却3 min。每管中加入800 uL LB液体培养基，37°C 150 rpm摇床温育复苏I h。培养后菌液4，000 rpm离心2 min,弃上清600 μ L，剩余菌液混匀后涂布到含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB平板上，37 °C倒置培养过夜。
[0023]阳性克隆的选择
挑取4个克隆，转接入装有5 mL的含有100 μ g/mL氨苄青霉素的LB培养基中，37°C培养12 h，利用质粒提取试剂盒Min1-Plasmid Rapid Isolat1n Kit (北京博大泰克生物基因技术有限公司)提取质粒。用以下反应体系进行酶切验证:10XBuffer H 2 μ L，DNA 5 yL, Pst I 0.5 μ L, Xhol 0.5 μ L，ddH20 将体系补足 20 yL。获得阳性质粒pRS424-TEFpr_6^rI 10
[0024]四、重组酿酒酵母S.cerevisiae ANl20/pRS424-TEFpr-6,^rII 的获得
Yro培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。SD-Trp培养基以g/L计:葡萄糖20，氨基酸干粉混合物6.7，YNB 20，固体培养基添加20琼脂粉。
[0025]挑取酿酒酵母AN120单菌落接种于5 mL的YPD液体培养基中，30°C、200rpm震荡培养16 h，取I mL菌液12000 rpm离心收集菌体，弃去上清，用100 μ L Buffer重悬菌体(1M DTT 10 μ L, 50% PEG 80 yL，2M LiAc 10 μ L)，加入重组质粒ρΙ?424-ΤΕΡρι.-.5￡ΓΠ Iμ L，轻轻混匀后于45°C温浴30 min,取出后将菌液涂布SD-Trp平板，30°C倒置培养。挑取单菌落至SD-Trp液体培养基中，30°C、200rpm震荡培养可生长即为阳性克隆。
[0026]五、重组酵母孢子的培育
Yro培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20。YPACE培养基以g/L计:KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20。产孢培养基以g/L计:KAc 20。
[0027]挑取重组酿酒酵母单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于I L的YPACE液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养24 ho将菌液于6000 rpmUO min无菌离心收集菌体，将菌体转移到I L的产孢培养基中继续培养2 - 3 d，期间用显微镜镜检产孢效果。6000 rpm、10 min离心收集菌体，用少量PBS缓冲液(pH 6.0)重悬菌体，经超声波细胞破碎仪处理I h (工作强度50%，工作时间I S，工作间隙3 S)，镜检破碎率约为90%即可。6000 rpm、10 min离心收集孢子。
[0028]六、重组孢子催化不对称转化制备(5)-苯乙二醇利用重组孢子催化不对称还原反应。
[0029]YPD液体培养基以g/L计:胰蛋白胨20，酵母提取物10，葡萄糖20，以去离子水配制;
YPACE液体培养基以g/L计:KAc 20，酵母提取物10，胰蛋白胨20，以去离子水配制； 产孢培养基以g/L计:KAc 20，以去离子水配制。
[0030]挑取重组酵母单菌落接种于10 mL的YPD液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养16 h。取10 mL培养液转接于I L的YPACE液体培养基中，于30°C、200 rpm振荡培养24ho将菌液于6000 rpmUO min无菌离心收集菌体，将菌体转移到I L的产孢培养基中继续培养2-3 d，期间用显微镜镜检产孢效果。6000 rpmUO min离心收集菌体，用少量PBS缓冲液(pH 6.0)重悬菌体，经超声波细胞破碎仪处理I h (工作强度50%，工作时间I S，工作间隙3 s)镜检破碎率约为90%即可。
[0031]破碎后的孢子在6000 rpm、10 min下离心收集。在以下体系中进行检测:1 mL 0.1mol/L 醋酸缓冲液(ρΗ5.0-5.5)，或 I mL 0.1 mol/L 磷酸缓冲液(pH 6.0-7.5)或 I mL 0.1mol/L Tris-HCl缓冲液(pH 8.0~9.0)中，加入6 g/L底物2-羟基苯乙酮，与2-羟基苯乙酮等摩尔量的辅酶NADPH，0.1 g/L湿孢子，混匀后在40°C恒温摇床上振荡反应4 h。
[0032]反应结束后，将反应混合物离心除去菌体，上清液加入2倍体积乙酸乙酯萃取，有机相用于分析。产物通过手性固定相高效液相色谱(Agillent HPl 100)进行分析，条件为Chiralcel 0Β-Η 柱(4.6 mm X 25 cm; Daicel Chemical Ind., Ltd., Japan)，流动相为正己烷/异丙醇(v/v，9/1)，流速0.4 mL/min，检测波长为215 nm。产物的光学纯度通过对映过量值来衡量。
[0033]产物(5)-苯乙二醇对映过量值的计算:
对映过量值(e.e.%) = [ (Q-Q / (Q+Q ] *100%,
产物(5)-苯乙二醇产率的计算:产率(％)= q/c0noo%,
式中G为反应后(对-对映体的浓度，?为反应后(5)-对映体的浓度，G为反应前底物2-羟基苯乙酮的浓度。
[0034]以微胶囊酶为催化剂，不对称生物转化反应后，产物均为(5)-苯乙二醇。
[0035](3)有益效果
成功从近平滑假丝酵母中获得了( Λ -羰基还原酶II，成功构建了目的基因的重组菌株 S.cerevisiae ANl20/pRS424-TEFpr-5crII 及其重组活性抱子。
[0036]重组酵母抱子51 cerevisiae ΑΝ120/ρΚ3424-ΤΕΡρ；Γ-5.??_τΙΙ 催化转化底物 2_ 轻基苯乙酮，获得高光学纯度和高产率的产物(5)-苯乙二醇。通过优化反应条件，在pH 6.0的磷酸缓冲液中，利用0.1 g/mL重组孢子对6 g/L底物2-羟基苯乙酮催化转化4 h，产物
(5)-苯乙二醇的光学纯度为99.3%e.e.，产率为99.0%。同时与大肠杆菌体系相比，反应时间由48 h缩短为4 h ;在极端温度和pH条件下，微胶囊酶都表现出了优良的耐受性；连续使用2