相转变分离纯化温敏性羟丁基壳聚糖的方法
【技术领域】
[0001]本发明涉及一种温敏性羟丁基壳聚糖的分离纯化方法，该方法适用于温敏性羟丁基壳聚糖衍生物的基础研究和大规模生产，该方法的使用摆脱了传统的浓缩沉淀方法无法有效沉淀的弊端，使温敏性羟丁基壳聚糖的大规模生产和质量控制成为可能。
【背景技术】
[0002]温敏性壳聚糖是一类对外界温度的变化刺激可以做出智能性响应的一类壳聚糖衍生物，其主要的特点是低温下为流动的液体，而当温度升高时，温敏性羟丁基壳聚糖可以发生智能性的相转变，转化为不流动的凝胶；其发生相转变的温度被称为最低临界溶液温度，该温度可以从10-37°C不等，且该温度可以调节。
[0003]温敏性壳聚糖发生相转变的机理主要是溶液体系中的各种物理作用力之间的动态平衡。即温敏性壳聚糖溶液体系中之间存在亲水-疏水、氢键以及范德华力等多种物理作用力，溶液体系中这三种作用力之间存在着一个动态平衡，共同维持着壳聚糖溶液体系的稳定，当温度升高时，氢键作用力被破坏，亲水-疏水作用占据主导地位，因而动态平衡被打破，溶液体系转变为凝胶体系。
[0004]目前温敏性壳聚糖主要包括羟丁基壳聚糖、壳聚糖-甘油磷酸盐以及PEG-壳聚糖等，在国内也有诸多专利开展上述工作，其中研究的热点为羟丁基壳聚糖，其主要原因是壳聚糖-甘油磷酸盐体系的最低临界溶液温度过高，不适合体内的拓展应用，且溶液-凝胶过程不可回复。羟丁基壳聚糖作为一种新型的壳聚糖衍生物，最近得到了飞速的发展，“一种温敏性壳聚糖衍生物-羟丁基壳聚糖的制备方法” (ZL200810033699.6)、“一种预防脑脊液漏的医用级温敏性羟丁基壳聚糖封闭剂的制备方法” (201110430139.6)等多项专利均涉及到羟丁基壳聚糖的制备及其应用。
[0005]羟丁基壳聚糖为一种两亲性高分子多糖，由于分子链中引入了亲水性基团-羟丁基，其水溶性明显改善，且乳化性能也得到了极大的改善。在羟丁基壳聚糖的产业转化过程中，产品的安全性是最重要的控制指标之一，而传统的工艺是对其进行分离纯化去除产品中的有毒杂质，最常用的方法为酒精分级沉淀，而低浓度下的羟丁基壳聚糖在酒精的溶解度大大提高限制了该方法的应用，因而针对上述难题提供一套科学完整的分离纯化方案是羟丁基壳聚糖产业转化中首当其冲的问题。而在国内公开或授权的专利中并没有出现专门针对温敏性羟丁基壳聚糖及其衍生物纯化的发明专利。
[0006]本发明专利为我们申请的有关羟丁基壳聚糖的系列专利之一，主要是为了解决产业转化过程中的实际难题，加强产品的质量控制，提高产品的安全性。
【发明内容】
[0007]本发明是针对低浓度温敏性羟丁基壳聚糖溶于酒精这一特殊现象，提供一套分离纯化的工艺流程。
[0008]为了实现以上目的，本发明提供一种纯化温敏性羟丁基壳聚糖的方法具体步骤如下:
第一步:分别配制不同浓度梯度的NaCl溶液，即低、中、高浓度，待用；
第二步:将浓度为0.1-5% (m/v)的温敏性羟丁基壳聚糖加入浓度为1-5%的NaCl溶液充分搅拌进行初级沉淀，；
第三步:将第二步得到的沉淀进行粉碎处理，然后放入浓度为10-15%的NaCl溶液中继续搅拌，进行二级沉淀；
第四步:将第三步得到的沉淀转入浓度为20-25%的NaCl溶液中继续搅拌脱水进行三级沉淀，得到白色状沉淀，然后结固液分离，得到粗品；
第五步:将得到的粗品通过有机溶剂的梯度洗脱去除NaCl，梯度分别为70%、80%、90%、100%得到粉状去盐沉淀；
第六步:粉状去盐沉淀40°C真空干燥去除有机溶剂和水分，得到温敏性羟丁基壳聚糖精制干粉。
[0009]通过上述步骤，可以有效去除小分子片段及副产物杂质，提高温敏性羟丁基壳聚糖的纯度。
[0010]本发明的优点:
1.本发明提供的方法解决了温敏性羟丁基壳聚糖低浓度溶液无法有机溶剂沉淀的难题
2.本发明提供的方法充分利用温敏性羟丁基壳聚糖的相转变机理，通过梯度NaCl溶液进行分级沉淀，达到了浓缩和纯化的目的。
[0011]3.本发明提供的方法提高了温敏性羟丁基壳聚糖的分子量并缩小了分子量的分布，达到了纯化的效果。
[0012]说明书附图
图1纯化后的温敏性羟丁基壳聚糖FT-1R图谱图2未纯化前的温敏性羟丁基壳聚糖的分子量及其分子量分布图3纯化后的温敏性羟丁基壳聚糖的分子量及其分子量分布。
【具体实施方式】
[0013]现结合实施例，对本发明作了详细描述:
实施例一
分别配制浓度分别为2%、10%和20%的氯化钠水溶液，以及2%的温敏性羟丁基壳聚糖水溶液。先将2%的氯化钠水溶液加入到搅拌状态的温敏性羟丁基壳聚糖水溶液500ml中，直到白色沉淀析出，滤去溶液后，加入10%的氯化钠水溶液500ml，充分搅拌，滤去溶液后，再加入20%的氯化钠水溶液500ml，充分搅拌，滤去溶液后，得到白色沉淀粗品。
[0014]将该沉淀依次用70%、80%、90%和100%的丙酮500ml洗涤除盐，最终得到白色沉淀，该沉淀用40°C真空干燥后，得到温敏性羟丁基壳聚糖精制纯品7.4g。
[0015]实施例二
分别配制浓度分别为4%、15%和20%的氯化钠水溶液，以及1%的温敏性羟丁基壳聚糖水溶液。先将4%的氯化钠水溶液加入到搅拌状态的温敏性羟丁基壳聚糖水溶液500ml中，直到白色沉淀析出，滤去溶液后，加入15%的氯化钠水溶液500ml，充分搅拌，滤去溶液后，再加入20%的氯化钠水溶液500ml，充分搅拌，滤去溶液后，得到白色沉淀粗品。
[0016]将该沉淀依次用70%、80%、90%和100%的丙酮500ml洗涤除盐，最终得到白色沉淀，该沉淀用40°C真空干燥后，得到温敏性羟丁基壳聚糖精制纯品3.2g。
[0017]实施例三
分别配制浓度分别为5%、15%和25%的氯化钠水溶液，以及0.5%的温敏性羟丁基壳聚糖水溶液。先将5%的氯化钠水溶液加入到搅拌状态的温敏性羟丁基壳聚糖水溶液500ml中，直到白色沉淀析出，滤去溶液后，加入15%的氯化钠水溶液500ml，充分搅拌，滤去溶液后，再加入25%的氯化钠水溶液500ml，充分搅拌，滤去溶液后，得到白色沉淀粗品。
[0018]将该沉淀依次用70%、80%、90%和100%的乙醇500ml洗涤除盐，最终得到白色沉淀，该沉淀用40°C真空干燥，得到温敏性羟丁基壳聚糖精制纯品1.6g。
[0019]实施例四
取精制的温敏性羟丁基壳聚糖纯品，采用KBr压片法进行FT-1R检测，得到红外谱图(附图1)，其特征峰可以较准确反应温敏壳聚糖的特征基团，结果显示该纯化方法并没有破坏温敏性羟丁基壳聚糖的化学结构。
[0020]实施例五
取温敏性羟丁基壳聚糖精品溶解在注射用水中得到浓度为0.8% (m/v)的溶液，然后进行分子量测定考察纯化前后的分子量变化(附图2，3)，结果表明经过纯化后，分子量从51万Da提高到71万Da，且分子量的分散系数从1.6缩小至1.3。
【主权项】
1.相转变分离纯化温敏性羟丁基壳聚糖的方法，主要利用相转变进行分离纯化，即温敏性羟丁基壳聚糖随着离子强度得增加会发生溶胶-凝胶的相转变，其主要特征为利用不同浓度梯度的盐溶液，将一定浓度的温敏性羟丁基壳聚糖进行分级沉淀，然后利用不同浓度梯度的有机溶剂进行梯度洗脱，最后40°c真空干燥得到纯化的温敏性羟丁基壳聚糖干粉。
2.权利要求1中所述的不同浓度梯度的盐溶液是指高、中、低三种不同浓度的盐溶液，其浓度分别为20-25%、10-15%以及1-5% (m/v)。
3.权利要求2中的盐溶液是指钠盐或钾盐，如NaCl、KCl、NaAC、KCUNa2SO4,K2SO4、等。
4.权利要求1中的一定浓度的温敏性羟丁基壳聚糖是指控制分离纯化前的制品浓度为 0.1-5% (m/v)。
5.权利要求1中的分级沉淀是指温敏性羟丁基壳聚糖首先在低浓度的盐溶液中进行初级沉淀，然后准入中浓度的盐溶液中进行二级沉淀，最后放入高浓度的盐溶液中进行三级沉淀。
6.权利要求1中所述的有机溶剂是指乙醇或丙酮。
7.权利要求1中所述的不同浓度梯度的有机溶剂是指其浓度梯度分别为100%、90%、80%和 70% (v/v)0
8.权利要求1中所述的梯度洗脱是分别采用权利要求7中的梯度有机溶剂从低到高依次进行洗脱除盐。
【专利摘要】本发明提供了一种利用相转变原理分离纯化温敏性羟丁基壳聚糖的方法，该方法主要利用温敏性羟丁基壳聚糖随着离子强度的增加会发生溶胶-凝胶的相转变，基于上述机理，本发明利用用不同浓度梯度的盐溶液，将一定浓度的温敏性羟丁基壳聚糖进行分级沉淀，然后利用不同浓度梯度的有机溶剂进行梯度洗脱，最后40℃真空干燥得到纯化的温敏性羟丁基壳聚糖干粉。通过以上方法，对温敏性羟丁基壳聚糖的化学结构不产生任何破话，同时有效地去溶液中杂质和小分子片段，提高了温敏性羟丁基壳聚糖的分子量及其分子量分布，取得了理想的分离纯化效果，最终解决了温敏羟丁基壳聚糖无法通过浓缩沉淀纯化的难题，使大规模生产和质量控制成为可能。
【IPC分类】C08B37-08
【公开号】CN104761657
【申请号】CN201410007429
【发明人】魏长征, 奚宏伟, 侯春林
【申请人】上海其胜生物制剂有限公司
【公开日】2015年7月8日
【申请日】2014年1月8日