一种秸秆腐解菌剂及其应用_2

文档序号:8454037阅读:来源:国知局
tM.Met油olismofcinnamic acidsbysomeClostridialesandemendationofthedescriptionsofClostridium aerotolerans,ClostridiumcelerecrescensandClostridiumxylanolyticum.IntJ SystEvolMicrobiol. 2001Nov;5UPt6) :2105-11。
[0034] 下述实施例中所用的假单胞菌巧seudomonassp.)ACCCNo. 11691于2006年9月 11日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、(简称ACCC,地址;北京市海 淀区中关村南大街12号,中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,邮编100081),自该 保藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、获得该菌株。
[0035] 下述实施例中所用的枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189于1978 年6月7日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、(简称ACCC,地址;北京 市海淀区中关村南大街12号,中国农业科学院农业资源与农业区划研究所,邮编100081), 自该保藏日起公众可从中国微生物菌种保藏管理委员会农业微生物中屯、获得该菌株。
[0036] 下述实施例中所用的培养基如下:
[0037] 1号培养基(查氏培养基);溶质及其浓度为;NaN〇3 3g/L,K2HP〇4 lg/L,KCl 0. 5g/ L,M拆〇4?7&0 0. 5g/L,FeS〇4 0.0 lg/L,庶糖20g/L,琼脂15g/L ;溶剂为水;pH7. 0+0. 1。 121°C高压灭菌15min。
[003引 2号培养基(PDA培养基);去皮的马铃馨200g切成小块,加入IL蒸馈水煮沸30 分钟,过滤,向滤液中加入葡萄糖和琼脂各15g,用蒸馈水定容至比,PH7.0 +0.l,12rC高 压灭菌ISmin。
[0039] 3号培养基(Mandels改良营养盐液);溶质及其浓度为;(畑4)2SO42g/L, M拆O4? 7&0 0. 5g/L,KH2PO40.Ig/L,玉米枯杆粉 2g/L;溶剂为水;pH7. 0 + 0. 1。121°C高压 灭菌15min。
[0040] 4号培养基(PCS改良培养基);溶质及其浓度为;蛋白腺5g/l,酵母粉Ig/l,玉 米枯杆粉5g/L,化C1 5g/L,K2HP〇4 lg/L,M拆〇4.7&00.35g/L,CaC〇3 3g/L;溶剂为水; pH7. 2+ 0.1。121°C高压灭菌15min。
[0041] 下述实施例中所述的吸附载体由凹凸椿粘±粉和食用菌渣按照2 ;3的质量比(干 重)混合而成。其中,凹凸椿粘±粉的粒径为0.10-0. 15mm,为安徽省明光市国星凹±有限 公司产品;食用菌渣为用农作物枯杆、木屑等作为代料栽培原料制成培养基,待食用菌收获 后培养基的剩余物,食用菌渣粒径大小为2. 00-3. 00mm。
[0042] 本实施例中,测定农作物枯杆的总分解率参考范式洗漆法,用纤维素分析仪(北 京和众视野科技有限公司产品,产品目录号为ANK0M220)按照该纤维素分析仪的说明书测 定枯杆中木质素、纤维素和半纤维素的质量,然后根据下述公式分别计算枯杆木质素的分 解率、枯杆纤维素的分解率、枯杆半纤维素的分解率和枯杆的总分解率:枯杆木质素的分 解率=(处理前枯杆的木质素质量-处理后枯杆的木质素质量)/处理前枯杆的木质素质 量X100% ;枯杆纤维素的分解率=(处理前枯杆的纤维素质量-处理后枯杆的纤维素质 量)/处理前枯杆的纤维素质量X100% ;枯杆半纤维素的分解率=(处理前枯杆的半纤维 素质量-处理后枯杆的半纤维素质量)/处理前枯杆的纤维素质量X100% ;枯杆的总分解 率=(处理前枯杆质量-处理后枯杆质量)/处理前枯杆质量X100%。实验重复=次,取 平均值。
[0043] 实施例1、菌剂的制备
[0044] 1、活化
[0045] 1. 1、将黑曲霉ZM-8接种在1号培养基上,置于30°C培养箱培养3天,得到活化的 黑曲霉ZM-8(AspergillusnigerZM-8)CCTCCN0;M209125。
[0046] 1. 2、将拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)CGMCCNO. 3. 6608和鲜绿青霉 (Penicilliumvisidicatum)CGMCCNO. 3. 5933分别接种在2号培养基上,置于30°C培养箱 培养3天,分别得到活化的拟康氏木霉(Trichodermapseudokoningii)CGMCCNO. 3. 6608 和鲜绿青霉(Penicilliumvisidicatum)CGMCCNO. 3. 5933。
[0047] 1. 3、将解木聚糖梭菌(Clostridiumx5danol}fticum)DSMNo. 6555、假单胞菌 (Pseudomonassp.)ACCCNo. 11691 和枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189 分别接种于装有100ml4号培养基的250mlS角瓶中,置于30°C培养箱静置培养3天, 分别得到活化的解木聚糖梭菌(Clostridiumx^anol^icum)DSMNo. 6555、假单胞菌 (Pseudomonassp.)ACCCNo. 11691 和枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189。
[0048] 2、扩大培养
[0049] 将步骤1中1. 1和1. 2活化的黑曲霉ZM-8、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)CGMCCNO. 3. 6608 和鲜绿青霉(Penicilliumvisidicatum)CGMCC NO. 3. 5933分别接入S个装有3号培养基的发酵罐和步骤1中1. 3活化的解木聚糖梭菌 (Clostridiumxylanolyti州m)DSMNo. 6555、假单胞菌(Pseudomonassp.)ACCCNo. 11691 和枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189分别接入两个装有4号培养基的 发酵罐,均在3(TC进行静止逐级扩大培养,扩大培养过程中接种量为5% -10% (体积百 分比含量),分别得到黑曲霉ZM-8(AspergillusnigerZM-8)CCTCCNO;M209125 发酵液 (IX108cfu/ml)(简称黑曲霉ZM-8发酵液)、拟康氏木霉(TrichodermapseudokoningU) CGMCCNO. 3. 6608发酵液(1Xl〇8c化/ml)(简称拟康氏木霉发酵液)、鲜绿青霉 (Penicilliumvisidicatum)CGMCCNO. 3. 5933 发酵液(IXl〇8cfu/ml)(简称鲜绿青霉发酵 液)、解木聚糖梭菌(Clostridi皿x5danol}fticum)DSMNo. 6555发酵液(lX108cfu/ml)(简 称解木聚糖梭菌发酵液)、假单胞菌(Pseudomonassp.)ACCCNo. 11691发酵液(1X108cfu/ ml)(简称假单胞菌发酵液)和枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189发酵液 (1X108c化/ml)(简称枯草芽抱杆菌发酵液)。
[0050] 3、菌剂的制备
[0化1] 3.1、菌剂A的制备
[0052]按照步骤2得到的解木聚糖梭菌发酵液、假单胞菌发酵液和枯草芽抱杆菌发酵液 的菌落形成单位(C化)数目比为1:1:1的比例进行混合得到发酵混合液A。该发酵混合液 A中,解木聚糖梭菌(Clostridiumx5danol}ft;ixum)DSMNo. 6555、假单胞菌(Pseudomonas sp.)ACCCNo. 11691 和枯草芽抱杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189 的含量均为 3.3X107c化/ml。将吸附载体和上述发酵混合液A混合,保持总含水量为75% (质量百 分比),3(TC静止培养3天待充分吸附后,35°C通风自然干燥得到菌剂A,菌剂A中的活 性成分的含量为IX107c化/g菌剂,菌剂A的活性成分为;解木聚糖梭菌(Clostridium x5danol}ft;ixum)DSMNo. 6555、假单胞菌(Pseudomonassp.)ACCCNo. 11691 和枯草芽抱 杆菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189。所述菌剂A中,解木聚糖梭菌(Clostridium x5danol}ft;ixum)DSMNo. 6555、假单胞菌(Pseudomonassp.)ACCCNo. 11691 和枯草芽抱杆 菌炬acillussubtilis)ACCCNo. 03189的菌落形成单位(cfu)数目比为1:1:1。
[0化3] 3. 2、菌剂B的制备
[0054] 按照步骤2得到的黑曲霉ZM-8发酵液、拟康氏木霉发酵液和鲜绿青霉发酵液的 菌落形成单位(C化)数目比为1:1:1的比例进行混合得到发酵混合液B。该发酵混合液B中,黑曲霉ZM-8(AspergillusnigerZM-8)CCTCCN0;M209125、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)CGMCCNO. 3. 6608 和鲜绿青霉(Penicilliumvisidicatum)CGMCC NO. 3. 5933的含量均为3. 3X107c化/ml。将吸附载体和上述发酵混合液B混合,保持 总含水量为75% (质量百分比),30°C静止培养3天待充分吸附后,35°C通风自然干燥 得到菌剂B,菌剂B中的活性成分的含量为1X107c化/g菌剂,菌剂B的活性成分为:黑 曲霉ZM-8(AspergillusnigerZM-8)CCTCCNO;M209125、拟康氏木霉(Trichoderma pseudokoningii)CGMCCNO. 3. 6608 和鲜绿青霉(Penicilliumvisidicatum)CGMCC NO. 3. 5933。所述菌剂B中,黑曲霉ZM-8(AspergillusnigerZM-8)CCTCCN0;M209125、 拟康氏木霉(Tric
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