细胞用细胞破碎使用BufferA(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mMNaCl、1.5mMMgCl2、lmMDIT、lmMPMSF、蛋白酶抑制剂?动物细胞 用（Nacalaitesque制）2 根）100mL悬浮，进行超声波破碎（TOMYUD-201、0UTPUT2、DUTY 60、2 分钟X2)。
[0119](5)将破碎液使用高速离心机（BeckmanHP-26XP、JA25. 50rotor)，以 14300rpm、 30分钟、4°C进行高速离心分离，由此将细胞破碎片以沉淀的形式而取出。
[0120] (6)将上清使用超高速离心机（HitachiCP80WX、P45ATrotor)，以 40000rpm、2 小 时、4°C进行超高速离心分离，由此使穹窿体级分以沉淀的形式而落下。
[0121 ] (7)向作为沉淀而得到的穹窿体级分中加入少量纯化用BufferA(50mM Tris-HCl(pH7.5)、75mMNaCl、1.5mMMgCl2、lmMDIT、lmMPMSF)，用杜恩斯匀浆器（Dounce homogenizer)进行悬浮。
[0122] (8)向上述（7)的溶液中加入等量的聚蔗糖/蔗糖缓冲液（Ficoll/Sucrose BufTer)(9〇mMMES-NaOH(pH6.5)、10mM磷酸钠（Sodiumphosphate)、lmMMgCl2、0.5mM EGTA、0. 02%NaN3、14%Ficoll-PM70、14%Sucrose)，良好地进行混合。
[0123] (9)将上述（8)的溶液使用超高速离心机（HitachiCP80WX、P45ATrotor)，以 25200rpm、10分钟、4°C进行超高速离心分离，将不要的物质以沉淀的形式而落下。
[0124] (10)将上清的穹窿体级分使用纯化用BufferA进行4倍稀释，使用超高速离心机 (HitachiCP80WX、P45ATrotor)，以40000rpm、2小时、4°C进行超高速离心分离，将穹窿体 级分以沉淀的形式而落下。
[0125] (11)向以沉淀的形式而得到的穹窿体级分中加入少量纯化用BufferA，用杜恩斯 匀浆器进行悬浮。
[0126] (12)用超高速离心机（HitachiCP80WX、P28Srotor)的离心管制作蔗糖的密度梯 度。由离心管的底部分别重叠 60%、50%、45%、40%、30%、20%鹿糖（311(：1'〇86)4111]^、51111、 5mL、5mL、5mL、5mL。将其制成 4 管。
[0127] (13)将上述（11)的溶液5mL与上述（12)的蔗糖密度梯度的20%层上重叠。
[0128](14)使用超高速离心机（HitachiCP80WX、P28Srotor)，以 25000rpm、16 小时、 4°C进行超高速离心分离。
[0129] (15)穹窿体包含于40-45%级分和50%级分的一部分中，用移液管将其回收。回 收全部40、45%级分（各5mL)，回收一半50%级分（2. 5mL)。
[0130] (16)将上述（15)的回收液用纯化用BufferA进行4倍稀释，使用超高速离心机 (HitachiCP80WX、P45ATrotor)，以40000rpm、2小时、4°C进行超高速离心分离，由此使穹 窿体级分以沉淀的形式而落下。
[0131] (17)向以沉淀的形式而得到的穹窿体级分中加入少量BufferA，用杜恩斯匀浆器 进行悬浮。
[0132] (18)使上述（17)的穹窿体试样通过0.22ym的滤器，取出碎片等。
[0133] (19)在流通了凝胶过滤用BufferA(50mMTris-HCl(pH7. 5)、75mMNaCl、l. 5mM MgCl2、lmMDTT) 2柱床体积而平衡化的凝胶过滤柱（GEHealthcareJapan制，Sephacryl S-500、26/60)上加载上述（18)的试样2mL，以流速0. 5mL/分钟分取各4mL。
[0134] (20)目标穹窿体级分在加载试样后140~190mL(分馏物No. 39-49)时出来，对 其进行回收，使用超高速离心机（HitachiCP80WX、P45ATrotor)，以40000rpm、2小时、 4°C进行超高速离心分离，由此使穹窿体级分以沉淀的形式而落下。（90~110mL(分馏物 No. 27-30)时，穹窿体的聚集体出来，所以将其取出而能够得到均一的穹窿体粒子）。
[0135] (21)向以沉淀的形式而得到的穹窿体级分中加入少量BufferA，用杜恩斯匀浆器 进行悬浮，将其作为最终纯化标准品。
[0136] 此处，图6的左侧为表示破碎（上述步骤（9))后的SDS-PAGE的结果的照片，分别 地示出了对于LZMVP_Gly3的上清（泳道A)、沉淀（泳道B)，对于LZMVP_Gly6的上清（泳 道C)、沉淀（泳道D)。另外，图6的右侧为表示蔗糖密度梯度离心分离（上述步骤（14)) 后的SDS-PAGE的结果的照片，分别地左侧的组a表示对于LZMVP_Gly3的结果，右侧的组b 表示对于LZMVP_Gly6的结果。另外，图7为表示对于LZMVP_Gly3的最终纯化标准品的电 子显微镜照片。
[0137] 〔5〕纯化的穹窿体的蛋白质定量
[0138] (1)使用PiasCorporation的BCA蛋白分析试剂盒（BCAProteinAssayReagent Kit)，对于如上述而得到的W-MVP、LZMVP_Gly3和LZMVP_Gly6,进行蛋白质定量。
[0139] (2)将试剂盒的试剂A5mL、试剂B100yL加入至15mL管中，良好地进行混合。
[0140] (3)准备加入了上述（2)的混合溶液500yL的1. 5mL的微量离心管（Eppendorf tube) 7 管。
[0141] (4)将事先准备的5个BSA标准溶液（1000、500、250、125、62. 5yg/ml)分别取 25yL，加入至上述（3)的1. 5mL管中，用涡流充分混合。
[0142] (5)将定量的穹窿体溶液（包含W-MVP、LZMVP_Gly3或LZMVP_Gly6)用超纯水稀 释而成的溶液制成2种（例如：5倍稀释和10倍稀释、25倍稀释和50倍稀释等）。
[0143] (6)将上述（5)中制作的穹窿体的稀释溶液2种分别加入至上述（3)的1. 5mL管 中，用涡流充分混合。
[0144] (7)将上述⑷和上述（6)的1. 5mL管在37°C下进行30分钟孵育。
[0145] (8)使用分光光度计，测定上述（7)的562nm下的吸光度（利用双缩脲反应的还原 Cu(+)与二喹啉甲酸（BCA)的配位进行比色定量）。
[0146] (9)首先，对于BCA，将测定结果用纵轴表示吸光度、横轴表示BSA浓度进行作图， 用最小二乘法求出近似曲线（标准曲线）。
[0147] (10)由上述（9)的标准曲线求出穹窿体的稀释溶液的浓度，由稀释倍率求出穹窿 体原液的浓度。
[0148] (11)使穹窿体原液的浓度乘以总液量，计算穹窿体的总收量。
[0149] (12)结果，每1L培养基W-穹窿体（比较例1)为3~5mg，与此相对，LZ-穹窿体 (LZMVP_Gly3(实施例1)、LZMVP_Gly6(实施例2))中得到超过约10倍的70~80mg的收 量。
[0150] 应该认为，本次公开的实施方式和实验例均以点例示，并没有限制。本发明的保护 范围不仅包括上述的说明，还包括权利要求书所示的、在与权利要求书等同的含义和范围 内所有的变更。
[0151]附图标iP,说明
[0152] 1人工生物粒子、2穹窿体、3MVP、4亮氨酸拉链、5帽、6肩部、7主体、8腰部、9帽螺 旋、10帽环、11药剂、12抗原、13靶细胞、14核内体。
【主权项】
1. 一种人工生物粒子（I)，其特征在于，在构成穹窿体（2)的腰部（8)的MVP(3)的N 末端分别整合入亮氨酸拉链（4)。
2. 根据权利要求1所述的人工生物粒子（1)，其中，在MVP(3)的N末端与亮氨酸拉链 (4)之间存在有连接子。
3. 根据权利要求2所述的人工生物粒子（1)，其中，所述连接子为3~6个甘氨酸。
4. 根据权利要求1所述的人工生物粒子（1)，其中，亮氨酸拉链来源于酵母的转录活化 因子GCM。
5. -种制造权利要求1~4的任一项所述的人工生物粒子（1)的方法， 所述方法将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧，使亮氨酸拉链基因表达。
6. 根据权利要求5所述的人工生物粒子（1)的制造方法，其特征在于，将MVP基因与亮 氨酸拉链基因不通过限制性内切酶位点而用编码连接子的基因连接。
【专利摘要】提供一种人工生物粒子(1)，其特征在于，在构成穹窿体(2)的腰部(8)的MVP(3)的N末端分别整合入亮氨酸拉链(4)，以及通过将亮氨酸拉链基因整合至MVP基因的N末端侧，使之表达的人工生物粒子(1)的制造方法，使用了能够作为可以应用于药物释放系统(DDS)等的微囊而使用的、能够有效地利用其大的内部空间的穹窿体的新型的人工生物粒子及其制造方法。
【IPC分类】C07K14-47, C12N15-09, C07K19-00
【公开号】CN104797709
【申请号】CN201380060146
【发明人】田中秀明
【申请人】国立研究开发法人科学技术振兴机构
【公开日】2015年7月22日
【申请日】2013年11月8日
【公告号】EP2921555A1, WO2014077195A1