阔的应用前景。
【附图说明】
[0031] 图1 :⑶47驼源单域抗体文库插入率检测图，从左到右的条带分别是：第一道为 DNA分子标记，其余孔道为VHH插入片段的PCR产物（单域抗体基因片段），其大小约为 500bp〇
[0032] 图2 :⑶47单域抗体纯化图，经镍柱树脂凝胶亲和层析纯化后的SDS-PAGE的电泳 图，结果显示，⑶47单域抗体经过该纯化过程，其纯度可达到90%以上。
【具体实施方式】
[0033] 下面结合实施例对本发明作进一步的说明。
[0034] 下述实施例中所涉及的仪器、试剂、材料等，若无特别说明，均为现有技术中已有 的常规仪器、试剂、材料等，可通过正规商业途径获得。下述实施例中所涉及的实验方法，检 测方法等，若无特别说明，均为现有技术中已有的常规实验方法，检测方法等。
[0035] 实施例1针对于⑶47的纳米抗体文库的构建
[0036] (1)首先合成⑶47多肽，将Img⑶47与弗氏佐剂等体积混合，免疫一只新疆单峰 驼，每周一次，共免疫7次，刺激B细胞表达抗原特异性的纳米抗体；
[0037] (2) 7次免疫结束后，抽取IOOmL骆驼外周血，分离淋巴细胞并提取总RNA ;
[0038] (3)合成cDNA并利用巢式PCR扩增VHH ;
[0039] (4)利用限制性内切酶PstI及NotI酶切16 μ g pCMECS3噬菌体展示载体及8 μ g VHH并连接两个片段；
[0040] (5)将连接产物转化至电转感受态细胞TGl中，构建CD47纳米抗体文库并测定库 容，库容大小为5. 85 X IO8CFU ;另外，对构建文库的插入率进行检测，随机挑选24颗单克隆 进行插入片段的PCR检测，判断VHH片段的插入率，结果显示出构建文库的插入率达到了 95. 8% (如图 1)。
[0041] 实施例2针对⑶47的纳米抗体筛选过程
[0042] (1)将溶解在 IOOmM NaHC03、pH 8. 2 中的 20 μ g CD47 偶联在 NUNC 酶标板上，4°C 放置过夜；
[0043] (2)第二天加入 100 μ L 0· 1 % BSA，室温封闭 2h ;
[0044] (3) 2h后，加入100 μ L噬菌体（2 X IO11个免疫骆驼单域抗体噬菌体），室温作用 Ih ；
[0045] (4)用PBS+0. 05% Tween-20洗5遍，以洗掉不结合的噬菌体；
[0046] (5)用IOOmM TEA(triethylamine)将与⑶47特异性结合的菌体洗脱下来，并感 染处于对数期生长的大肠杆菌TGl细胞，37°C培养lh，产生并纯化噬菌体用于下一轮的筛 选，相同筛选过程重复3~4轮，逐步得到富集。
[0047] 实施例3用噬菌体的酶联免疫方法（ELISA)筛选特异性单个阳性克隆
[0048] (1)从上述3~4轮筛选后含有噬菌体的细胞培养皿中，挑选96个单菌落并接种 于ImL含有100ug/mL的氨苄青霉素的TB培养基（1L TB培养基中含有2. 3g KH2PO4,12. 52g K2HP04，12g peptone，24g yeast extract，4mLglycerol)中，生长至对数其月后，加终浓度 ImM 的IPTG，28°C培养过夜。
[0049] (2)利用渗透法获得粗提抗体，并将抗体转移到经抗原包被的ELISA板中，在室温 下放置lh。
[0050] (3)用PBST洗去未结合的抗体，加入mouse anti-HA tag antibody (抗鼠抗HA抗 体，购自北京康为世纪生物科技有限公司），在室温下放置lh。
[0051] (4)用 PBST 洗去未结合的抗体，加入 anti-mouse alkaline phosphatase con jugate (山羊抗小鼠碱性磷酸酶标记抗体，购自艾美捷科技有限公司），在室温下放置 lh〇
[0052] (5)用PBST洗去未结合的抗体，加入碱性磷酸酶显色液，置于酶标仪上，在405nm 波长，读取吸收值。
[0053] (6)当样品孔OD值大于对照孔OD值3倍以上时，判为阳性克隆。
[0054] (7)将阳性克隆的菌转摇在含有10〇Ug/mL的LA液体中以便提取质粒并进行测序。
[0055] 根据序列比对软件Vector NTI分析各个克隆株的基因序列，把⑶R3序列相同的 株视为同一克隆株，而其序列不同的菌株视为不同克隆株，其抗体的VHH链的氨基酸序列 如SEQ ID N0:9所示，由4个框架区和3个互补决定区组成，其中，4个框架区的氨基酸序 列分别如 SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4 所示，3 个互补决定区的 氨基酸序列分别如SEQ ID NO :5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7所示。
[0056] 实施例4纳米抗体在宿主菌大肠杆菌中表达、纯化
[0057] (1)将上述测序分析所获得不同克隆株的质粒电转化到大肠杆菌WK6中，并将其 涂布在LA+2% Gl μ cose (即含有氨苄青霉素和葡萄糖）培养平板上，37°C培养过夜；
[0058] (2)挑选单个菌落接种在5mL含有氨苄青霉素的LB培养液中，37 °C摇床培养过 夜；
[0059] (3)接种ImL的过夜菌种至330mL TB培养液中，37°C摇床培养，培养到OD值达到 0· 6~0· 9时，加入IPTG，28°C摇床培养过夜（约12-16h);
[0060] (4)离心，收菌；
[0061] (5)利用渗透法，获得抗体粗提液：用4mL高糖溶液TES处理细胞2h，然后8mL 1/4TES处理2h ;离心后取上清液用于后续纯化；
[0062] (6)使用镍柱离子亲和层析的方法纯化单域抗体：蛋白液与镍柱混合反应Ih ; 10 XPBS洗涤5次，含20mM咪唑的PBS洗涤2次，含50mM的PBS洗涤1次，ImL含IOOmM咪 唑的PBS洗涤，含500mM咪唑的PBS洗脱3次；收集洗脱的蛋白液，跑胶观察其纯度（图2 所示），并将其超滤至IXPBS中置于-80°C保存。
【主权项】
1. 一种针对⑶47的单域抗体，其特征在于：其氨基酸序列如SEQ ID NO :9所示，由4个 框架区和3个互补决定区组成，其中，4个框架区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO :1、SEQ ID NO :2、SEQ ID NO :3、SEQ ID NO :4所示，3个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO : 5、SEQ ID NO :6、SEQ ID NO :7 所示。
2. 权利要求1所述的针对CD47的单域抗体在检测CD47中的应用。
3. 权利要求1所述的针对CD47的单域抗体在制备检测CD47的试剂或试剂盒中的应 用。
4. 权利要求1所述的针对CD47的单域抗体在制备CD47治疗性抗体药物中的应用。
5. -种编码权利要求1所述的单域抗体的核酸，其特征在于：其核苷酸序列为以下序 列之一： (1) 如SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列； (2) SEQ ID NO. 8所示的核苷酸序列添加、取代、缺失或插入一个或若干个核苷酸的序 列； (3) 在严格条件下，与（1)或（2)的核苷酸序列杂交的核苷酸序列； (4) 由于遗传密码子的简并性区别于（1)、（2)、（3)的核苷酸序列的核苷酸序列。
6. -种表达载体，其特征在于：其包含有权利要求4所述的核酸。
7. -种宿主细胞，其特征在于：其包含有权利要求6所述的表达载体。
8. 根据权利要求7所述的宿主细胞，其特征在于：所述宿主细胞的受体菌为大肠杆菌。
【专利摘要】本发明公开了一种针对CD47的单域抗体，为针对CD47胞外段的单域抗体，其氨基酸序列如SEQ ID NO：9所示，由4个框架区和3个互补决定区组成，4个框架区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：1、SEQ ID NO：2、SEQ ID NO：3、SEQ ID NO：4所示，3个互补决定区的氨基酸序列分别如SEQ ID NO：5、SEQ ID NO：6、SEQ ID NO：7所示。本发明还公开了编码该单域抗体的核酸，含有该核酸的表达载体，含有该表达载体的宿主细胞。本发明的针对CD47的单域抗体可与CD47特异性结合，在研发CD47治疗性抗体药物方面具有广阔的应用前景。
【IPC分类】C12N15-70, G01N33-68, C12N1-21, C07K16-28, A61K39-395, A61P35-02, C12N15-13, A61P35-00
【公开号】CN104804093
【申请号】CN201510278379
【发明人】万亚坤, 孟红, 卞忠华
【申请人】江苏春申堂药业有限公司
【公开日】2015年7月29日
【申请日】2015年5月27日