hoI和BamHI两个酶切位点，用于下一轮的基因叠加组装。所以，pBDL6063载体理论上 可以承载在其接受范围内的无限多个基因。
【附图说明】
[0023] 图1是pRS425-ADH2p-ADH2t-SalI载体鉴定的电泳图，其中：
[0024] 1)Marker(8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp)；
[0025] 2)SalI限制性内切酶鉴定，得到大小为8696bp的一条带；
[0026] 3)PvuII限制性内切酶鉴定，得到大小为6401bp、1278bp、1017bp的三条带；
[0027] 4)pRS425-ADH2p-ADH2t-SalI质粒；
[0028] 图2是pBDL6063载体鉴定的电泳图，其中：
[0029] 1)BamHI限制性内切酶鉴定，得到大小为8706bp的一条带；
[0030] 2)Marker(8000bp、5000bp、3000bp、2000bp、1000bp、750bp、500bp、250bp、 100bp)；
[0031] 3)BglII限制性内切酶鉴定，得到大小为8706bp的一条带；
[0032] 图3是pBDL6063载体图谱（含有实验室前期克隆的GeneA基因序列）；
[0033] 图4是pBDL6063载体叠加3个基因的组合策略示意图；
[0034] 图5是pBDL6063载体的基因表达验证HPLC图谱，（a)是生物合成lasiodiplodin 的3个基因的表达验证HPLC图谱，（b)是生物合成lasiodiplodin的3个基因加生物合成 Hypothemycin的HsOMT基因的表达验证HPLC图谱，其中：
[0035] 1)lasiodiplodin(甲基基团在3位碳原子侧链羟基上）
[0036] 2)不含甲基基团的lasiodiplodin类似物
[0037] 3)甲基基团在5位碳原子侧链羟基上的lasiodiplodin类似物
[0038] 4)在3位和5位碳原子侧链羟基上都含有甲基基团的lasiodiplodin类似物
【具体实施方式】
[0039] 实施例lpBDL6063载体的构建
[0040] 1?实验材料
[0041] 酵母表达载体pRS425为实验室保存载体；限制性内切酶、T4DNA连接酶购自NEB 公司；DNA聚合酶和DNAmarker购自北京全式金生物公司；质粒小提试剂盒、凝胶回收试剂 盒购自天根公司；TOP10感受态购自康维世纪公司；其它试剂均为国产分析纯产品。
[0042] 2.实验方法及结果
[0043] 首先在商业酵母表达载体pRS425上加入乙醇脱氢酶ADH2的启动子ADH2p和终止 子ADH2t，两个基因均由本实验室保存。先将ADH2p基因用相应的限制性内切酶进行双酶切 反应，表达载体PRS425用同样的内切酶酶切，连接并常规转化入大肠杆菌感受态T0P10,筛 选阳性克隆，得到正确的pRS425-ADH2p载体。再用同样的方法连接ADH2t基因，得到正确 的pRS425-ADH2p-ADH2t载体。
[0044] 参考pRS425-ADH2p_ADH2t序列及酶切位点，设计引物引入酶切位点。在启动子 ADH2p前加入SalI酶切位点，在终止子ADH2t后加入BamHI和BglII酶切位点。引物 序列见表1，其中425F1序列中引入突变增加SalI酶切位点，425R2序列中引入突变增加 BamHI和BglII酶切位点。具体方法如下：
[0045]以pRS425-ADH2p-ADH2t载体为模板，425F1/425R1 为引物，PCR扩增出引入SalI 酶切位点的片段1 ;同时，425F2/425R2和425F3/425R3为引物，PCR扩增出引入BamHI和 BglII酶切位点的片段2和片段3,再将片段2和片段3通过融合PCR的方法融合在一起， 命名为片段23。将上述片段连接至pJETl. 2克隆载体，常规转化入大肠杆菌感受态T0P10， 筛选阳性克隆，送公司测序，测序正确的质粒分别命名为PJET-1和pJET-23。
[0046] 分别将pJET-1和pRS425-ADH2p-ADH2t质粒载体用NotI和NdeI双酶切处 理，回收片段和载体，连接并转化，筛选阳性克隆，酶切鉴定得到含有SalI酶切位点的载 体pRS425-ADH2p-ADH2t-SalI(图 1);再分别将pJET-23 和pRS425-ADH2p-ADH2t-SalI 质粒载体用XhoI和DraIII双酶切处理，后续实验步骤同上，最终获得验证正确的载体 pRS425-ADH2p-ADH2t-SalI-BamHI-BglII(图 2)，并命名为pBDL6063 (图 3)。
[0047] 表1 PRS425M载体构建引物
[0048]
【主权项】
1. 一种可用于多个基因叠加顺式表达的载体，其特征是：含有两对同尾酶的限制性内 切酶酶切位点序列，且通过这两对同尾酶可以实现多个基因叠加在同一个表达载体上；所 用的表达载体源于酵母表达载体、pET系列的原核表达载体或真核表达载体pEGFP。
2. 权利要求1所述的载体，所述两对同尾酶选自以下同尾酶对中的两对：Xho I/Sal I、BamH I/Bgl II、Xba I/Nhe I、Spe I/Nhe I 或 Xba I/Spe I。
3. 权利要求1所述的载体，所用的表达载体是酵母表达载体，选自pRS425、pRS423、 pRS426、pRS316 或 pRS403。
4. 权利要求3所述的载体，载体基因表达盒所用的启动子和终止子是乙醇脱氢酶ADH2 的启动子ADH2p和终止子ADH2t。
5. 权利要求4所述的载体，所用的表达载体是酵母表达载体pRS425。
6. -种构建多个基因叠加顺式表达载体的方法，其特征是：在启动子上游和终止子下 游分别引入限制性内切酶识别序列。
7. 权利要求6所述的方法，首先在待改造的表达载体上加入启动子和终止子，再通过 PCR定点突变的方法分别在启动子上游和终止子下游引入限制性内切酶识别序列。
8. 权利要求6所述的方法，首先在酵母表达载体pRS425上加入乙醇脱氢酶ADH2的启 动子ADH2p和终止子ADH2t，再通过PCR定点突变的方法在启动子ADH2p上游引入Sal I内 切酶识别序列，在终止子ADH2t下游引入BamH I和Bgl II两个内切酶识别序列，最终得到 用于多个基因叠加顺式表达的酵母表达载体。
【专利摘要】一种可用于多个基因叠加顺式表达的载体，其特征是：含有两对同尾酶的限制性酶切位点序列，通过这两对同尾酶可以实现多个基因叠加在同一个载体中。所述载体的构建方法是通过PCR定点突变在启动子上游和终止子下游分别引入相应的限制性内切酶识别序列。在该表达载体中，每个基因都带有独立的启动子和终止子，构成独立的表达元件，再利用同尾酶实现独立表达元件的叠加组装，各基因的表达相对独立。该载体实现多个基因叠加非常方便快捷只需将目的基因分别克隆至表达载体的多克隆位点处，再利用两对同尾酶完成后续的组装。
【IPC分类】C12N15-81
【公开号】CN104830893
【申请号】CN201510237093
【发明人】徐玉泉, 王晓婧, 张维, 刘航
【申请人】中国农业科学院生物技术研究所
【公开日】2015年8月12日
【申请日】2015年5月11日