专利名称：类胡萝卜素相关酶基因、重组酵母载体及转基因方法和转基因酵母的制作方法
技术领域：
本发明属于生物技术领域，特别是涉及一种类胡萝卜素重组酵母载体及转基因酵母。
背景技术：
世界人口已达到60亿，其中有20亿缺乏营养。全世界有1.24亿儿童缺乏β-胡萝卜素，每年有50万儿童因β-胡萝卜素缺乏而致盲。我国居民普遍确乏β-胡萝卜素，在我国每一分钟有一名盲人产生。60％的小学生是近视，幼儿弱视在我国普遍存在，需要补充β-胡萝卜素。
β-胡萝卜素具有预防肿瘤、抑制致癌因素、预防心血管疾病并延缓疾病的进程、降低慢性肝炎的炎症与纤维化程度、改变各种免疫指标而用来治疗艾滋病等临床作用。除此之外，β-胡萝卜素是被世界卫生组织(WHO)确认为四大营养缺乏病之一的维生素A(视黄醇retinol)的前体。β-胡萝卜素是补充维生素A的最好的途径，因为直接摄食维生素A量过多，会引起颅内高压(假性脑瘤)、高维生素A血症、新生儿畸形、头痛、皮肤病等。尽管β-胡萝卜素广泛存在于绿叶蔬菜和水果中，但由于它在脂溶状态下才能被吸收，而没有油脂的情况下不能被吸收，因而导致人们普遍缺乏β-胡萝卜素，尤其在亚洲、非洲、欧洲等国家。β-胡萝卜素缺乏的常见症状是包括从弱视到失明一系列眼病。
类胡萝卜素是一类包括β-胡萝卜素、虾青素、叶黄素和番茄红素的天然色素，常被用作食品添加剂的着色剂和营养强化剂，同时类胡萝卜素还具有预防血管硬化、抑制肿瘤发生、增加宿主免疫力、抗氧化和抑制自由基产生等生理功能。目前，β-胡萝卜素已被FAO和WHO等国际组织认定为A类营养色素，并在50多个国家和地区获准作为营养、着色双重功用的食品添加剂而被广泛应用于保健食品及医药和化妆品工业。国外几家大的生产β-胡萝卜素的厂家有瑞士罗氏，年产量350吨；德国BASF公司年产量150吨；匈牙利Darius公司，具体产量没有查到。世界年需求量在1000吨，而目前年产量只有600吨。我国β-胡萝卜素产量只有几百公斤，而实际需求量达100吨。国内主要生产企业有南京天舒生物工程有限公司(从胡萝卜中提取)，上海市工业微生物研究所(天然微生物发酵)，武汉抗菌素厂(天然微生物发酵)。
类胡萝卜素的生产方法有很多，主要有化学合成法、植物提取法和微生物发酵法三种。其中由微生物发酵法生产类胡萝卜素有诸多优点，有逐步实现产业化的趋势。用微生物发酵法生产的类胡萝卜素安全无毒，被权威机构认为是天然食品添加剂。下面就将β-胡萝卜素主要的生产方法进行简要的介绍。
1.化学合成法罗氏公司于1954年最先生产β-胡萝卜素，1972年BASF公司也开始生产，这两家公司都依靠一系列维生素A的前体物来制备。
(1)Roche法以β-紫罗兰酮为起始原料，经C14-醛、C16-醛生成C19-醛，与一分子乙炔缩合，生成中间体15，15’-脱二氢二羟基-β-胡萝卜素。再通过Lindlar催化剂部分氢化和酸催化除去2分子水，生成15，15’-顺-β-胡萝卜素，最后异构化生成β-胡萝卜素，总收率达28％。
(2)BASF法利用Wittig试剂将2分子C15季磷盐与一分子2，7-二甲基辛三烯二醛缩合，然后异构化即得β-胡萝卜素，收率超过80％。
(3)双维生素A缩合法从维生素A醋酸酯(vitamin A acetate)开始，水解得维生素A醇，然后分别制成维生素A三苯基磷盐化合物和维生素A醛，再以甲醇钠为缩合剂，经过Witting反应缩合成β-胡萝卜素。合成维生素A的工厂采用本法，具有相对的优势。用此法制备β-胡萝卜素可降低生产成本。
缺点化学合成迅速的同时带来一些负面效应，在合成β-胡萝卜素的同时生成的一些副产品有毒性，所以该法生产的β-胡萝卜素不为人们所接受。
2.生物提取法可以从含胡萝卜素较多的植物，如胡萝卜、沙棘、苜蓿等中提取。将上述富含β-胡萝卜素的植物榨汁，加热，收集沉淀物。沉淀物用乙醇、乙醚等溶剂提取，提取液蒸去溶剂即得到β-胡萝卜素。此外，从蚕中提取，收率不低。在桑蚕业发达地区废物利用，可以形成一定规模，有一定经济价值，但成本高。
3.采用微生物发酵法生产前苏联和东欧几个国家用三孢布拉霉菌发酵生产β-胡萝卜素，已达到工业化。因微生物发酵生产过程属于生物化学过程，具有反应条件温和、生产周期短、菌体可综合利用、发酵过程易于产业化等优点而成为当今生物技术领域的研究热点。
国外用三孢布拉霉菌(Blakeslea tripora)发酵生产技术比较成熟。三孢布拉霉菌属于毛霉目，笄霉科布拉霉菌属的菌种，生长十分迅速，生物量高，培养48h每升发酵液可获50g以上的干菌体。产β-胡萝卜素的能力强，培养5-6天总胡萝卜素产量在1g/L以上，其中80％-90％是β-胡萝卜素。国外微生物合成类胡萝卜素的研究主要集中在丝状真菌(三孢布拉霉)和红酵母方面，其发酵水平已达到中试和能批量生产的程度。国内利用三孢布拉霉的研究也已通过中试，但利用红酵母的研究刚刚受到重视。三孢布拉霉由于菌酶生殖方式的原因其性状易衰退，蓝藻养殖受地域要求苛刻等都限制了它们的发展。一般认为，利用酵母生产类胡萝卜素虽然目前色素发酵水平不如三孢布拉霉的高，但酵母具有营养要求简单、生长周期短及菌体营养丰富等许多优点，具有很大的实用价值和开发前景。
目前，有利用化学合成和植物藻类提取来制备β-胡萝卜素的，但是，化学合成产物及其杂和物对人体毒性较大，通常已被禁用于食品色素。若从西红柿、胡萝卜等植物和盐藻类中提取类胡萝卜素混合物，但是其中β-胡萝卜素含量甚低，我们测试过黑龙江省的主要西红柿品种的类胡萝卜素混合物中95％以上仅是番茄红素，成熟的西红柿中几乎不存在β-胡萝卜素。因而从植物中提取天然β-胡萝卜素受地域条件、原料来源、提取得率等限制，生产成本较高，而工业化生产转基因酵母比较容易，且克服了上述的缺点。应用酵母作为生物反应器生物合成天然β-胡萝卜素，可直接通过发酵提高主食及发酵食品的营养成分，符合人们的饮食习惯、符合社会对β-胡萝卜素的迫切需要。
技术内容本发明的目的就是提供一种类胡萝卜素相关酶基因、重组酵母载体及转基因方法和转基因酵母。
本发明的类胡萝卜素生物合成相关酶基因，其包括1)法尼脂焦磷酸合酶(FPS，farnesyl pyrophosphate synthase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的FPS，其碱基序列片段为ATT TGT ATA CGC AGG ACA GAG ATC2)牦牛儿牦牛儿焦磷酸合酶(GGPS，geranylgeranyl pyrophosphatesynthase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的GGPS，其碱基序列片段为ATG GTG GAT TCA TGG GTG GTT CAG3)八氢番茄红素合酶(PSY，phytoene synthase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的PSY，其碱基序列片段为ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTC
4)八氢番茄红素脱氢酶(PDS，phytoene desaturase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的ZDS，其碱基序列片段为ATG TCT CAA TTG GGA CAC ATA TCC5)ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS，zeta-carotene desaturase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的ZDS，其碱基序列片段为ATG TCT TGT TCT TCT GCT TCT CTC6)番茄红素β-环化酶(LycB，β-Lycopene cyclase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的LycB，其碱基序列片段为ATG GAT ACT TTA GTG AAA ACT CCC7)番茄红素ε-环化酶(LycE，ε-Lycopene cyclase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的LycB，其碱基序列片段为ATG GAG TGT TTC AAA GTT CGA AAG本发明的类胡萝卜素重组酵母载体，其特征在于利用FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE基因的PCR产物，连接到T-载体，再与酵母穿梭载体连接，构建重组酵母载体pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB、pPIC9-LycE。
本发明类胡萝卜素自由基因转基因方法，取酵母感受态细胞分别与FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE的表达区或包含表达区的DNA片段混匀，不加任何修饰分别直接转化，转移到电击杯中，电击后加入山梨醇，转移混合物到无菌的离心管，涂混合物在固体培养基平板上，直到产生单菌落，得到转基因酵母。
本发明类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母是含有外源类胡萝卜素生物合成相关酶基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE。
本发明的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母可以生物合成类胡萝卜素。
本发明的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，可以生物合成一种使类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母体细胞呈圆形的蛋白-YRP。
本发明的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，可以生物合成一种使实验小鼠健康的蛋白-RHP。
本发明的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，其特征在于类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母菌体。
图1是本发明未转基因酵母美蓝染色后，10×40显微镜下酵母形态观察；图2是本发明转基因酵母美蓝染色后，10×40显微镜下酵母形态观察，类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母细胞体态变圆；图3是本发明圆形转基因酵母与非转基因酵母RT-PCR分析结果，结果表明类胡萝卜素相关酶基因作为外源基因，在转基因酵母中表达；图4是本发明圆形转基因酵母与非转基因酵母Northern blot分析结果，结果表明类胡萝卜素相关酶基因作为外源基因，在转基因酵母中能够大量表达；图5是本发明圆形转基因酵母与非转基因酵Western blot分析结果，结果表明类胡萝卜素相关酶基因作为外源基因，在转基因酵母中产生特异蛋白-YRP(Yeast road protein).推测此蛋白可能与转基因酵母体细胞与非转基因体细胞相比肥硕变圆有关；图6本发明实验健康小鼠灌胃用转基因酵母与非转基因酵母RT-PCR分析结果，结果表明类胡萝卜素相关酶基因作为外源基因，在转基因酵母中表达；图7是本发明实验健康小鼠灌胃用转基因酵母与非转基因酵母Northern blot分析结果，结果表明类胡萝卜素相关酶基因作为外源基因，在转基因酵母中能够大量表达；图8是本发明实验健康小鼠灌胃用转基因酵母与非转基因酵Western blot分析结果，结果表明类胡萝卜素相关酶基因作为外源基因，在转基因酵母中产生特异蛋白-RHP(Rise health protein)，推测此蛋白可能与实验小鼠健康并且比对照组寿命长有关。
具体实施例方式本研究所用基因克隆自枸杞中。
1.PSY(八氢番茄红素合成酶)PSY催化GGPP转化成八氢番茄红素，由PSY基因编码，其cDNA长1.3kb，编码423个氨基酸。
2.PDS(八氢番茄红素脱氢酶)PDS催化八氢番茄红素向ζ-胡萝卜素转化，由PDS基因编码，其cDNA长2.1kb，编码582个氨基酸。
利用PDS，PSY基因的PCR产物，连接到T-载体，再与酵母穿梭载体连接，构建了重组酵母载体pPIC3.5PDS、pPIC9PSY。
基因的获取从质粒中利用PCR方法扩增出PSY、PDS基因cDNA片段T-载体的连接用PDS，PSY基因的PCR产物，纯化回收后与T-载体进行连接。
T-载体的酶切利用Not I，BamH I限制性内切酶切割含有外源基因的T-载体，纯化回收，获得具有Not I，BamH I粘端的片段。
酵母穿梭载体的连接利用Notl，BamH I限制性内切酶切割酵母载体pPIC3.5，纯化回收后与T-载体的酶切产物连接获得重组酵母穿梭载体pPIC3.5PDS、pPIC9PSY。
用甲醇酵母菌液在YPD平板上划线，28℃培养两天。挑取单菌落于250ml YPD液体培养基中28℃振荡培养，至OD600为1.3-1.5，1500g4℃5分钟收集菌体，无菌水250ml重悬沉淀，反复洗涤两次。再用20ml 1mol/L山梨醇重悬沉淀一次，最后收集沉淀于1.5ml离心管中，-70℃储存。
酵母载体的线性化用Bgl II酶切酵母载体。
电击转化
取80ul的酵母感受态细胞与0.8-1ug的线性化载体DNA混匀，转移到冰预冷的0.2cm的电击杯，于冰上放置5分钟，1500V电击后立即加入1ml冰预冷的山梨醇，转移混合物到无菌的离心管，涂200-600ul的混合物在MD平板上。28℃培养直到产生单菌落。利用电击法将重组酵母载体导入Pichia酵母，获得红色转基因酵母菌株1600株。
转化菌株的分子鉴定1.PCR鉴定酵母基因组的提取挑取单菌落至5mlYPD液体培养基，28-30℃培养16小时，12000rpm离心2分钟，收集沉淀，1mlddH2O剧烈振荡悬浮沉淀，离心，去上清。加入200ulBreaking buffer，悬浮沉淀，加入200ul饱和酚，振荡。加入100-200ul0.5mm玻璃珠，votex3-5分钟，12000rpm离心3分钟。取上清，用2.5倍的无水乙醇沉淀DNA。纯化按《分子克隆》进行。
PCR检测PSY基因引物5’端CTC GAG AAA A6A GAG GCT GAA GCT GGA TCCATG ATT TGT ATA CGC AGG ACA GAG ATA CGG。3’端GC GGC CGC TTATTT CAG CCT CTT GTA TAT CTT。扩增条件(总反应体积25ul)94℃3分钟，94℃1分钟，58℃1分钟，72℃1`30秒，30个循环，72℃10分钟。特异带大小约1.3kb。
PDS基因引物5’端CTC GAG AA A AGA GAG GCT GAA GCT GGA TCCATG CCC TTT CAC CTT CAA CTT AGT GAA。3’端GC GGC CGC TCA GTTTGG AAT GCT TGC TTC TGC。扩增条件(总反应体积25ul)94℃3分钟，94℃1分钟，54℃1分钟，72℃2分钟，30个循环，72℃10分钟。特异带大小约2.1kb。
PCR产物用1.2％琼脂糖凝胶电泳检测，溴化乙锭染色，紫外分析。
2.Southern鉴定(1)探针的标记用引物从质粒pPIC3.5PDS、pPIC9PSY DNA中PCR扩增出1.3kb、2.1kb的特异目的片段，1％琼脂糖凝胶电泳，进行回收与纯化，以回收产物作探针，采用随机引物法探针标记，用于杂交。方法参照DIG试剂盒说明进行。
1)酶切片段或PCR产物用试剂盒进行回收，溶于20μl体系。回收产物加入1～2μlDNA分子量标记物，DGL2000或λ-DNA，沸水浴加热变性10min。立即置于冰上，加入试剂Vial5 2μl Hexanucleotide Mix(随机六聚体引物)Vial6 2μl dNTP labeling mixture(10×dNTPs，标记混合物)Vial7 1μl Klenow enzyme混匀，稍离心，37℃进行反应1h以上，因延长时间有助于探针产量的提高，故37℃过夜。
2)反应结束后，加入2μl 0.2mol/L EDTA(pH8.0)终止反应。按常规方法进行纯化。即加入1/10体积的3mol/L NaAC，2倍体积的无水乙醇，上下颠倒数次混匀，-20℃放置2h。
3)12000rpm离心15min，弃上清，用75％乙醇洗涤沉淀2次，室温晾干。加入20μl TE溶解沉淀，-20℃保存备用。
(2)探针标记后的检测1)取1μl探针作1∶1、1∶10、1∶100、1∶1000、1∶10000、1∶100000连续梯度稀释，同时作阳性对照。将稀释的探针取1μl点在尼龙膜上。将尼龙膜置入Washing buffer(Maleicacid buffer，0.3％Tween20)中洗2min。
2)将尼龙膜在1×blocking solution中封闭30min。
3)将尼龙膜在含有anti-DIG-AP(1∶5000)的1×blockingsolution中封闭30min。在充足的Washing buffer中洗膜2次，每次15min。
4)在detection buffer中平衡3min。将尼龙膜转移到含有NBT/BCIP的detection buffer中，暗室下静置2h以上，观察斑点颜色，结果表明探针标记效果良好。
3.斑点杂交1)将样品(包括质粒对照、PCR阳性对照与待检测的植物基因组DNA)在沸水浴中加热变性10min，用移液器分别取样品2～5μl，按顺序点在事先准备好的尼龙膜上，室温晾干，固定，即80℃烘烤1～2h，4℃保存备用或直接进行以下实验。
2)预杂交将尼龙膜放入杂交管中，加入适量的预杂交液(按20ml/100cm2标准)，放入杂交仪中，68℃预杂交8h以上；3)杂交弃预杂交液，加入含有预变性探针的杂交液(按2.5ml/100cm2标准)，68℃杂交16h；4)检测杂交结束后，弃去杂交液，加入适量的洗膜液I(2×SSC，0.1％SDS)，室温洗膜2次，每次5min；再加入洗膜液II(0.1×SSC，0.1％SDS)，于68℃洗膜2次，每次15min；将尼龙膜取出，放入平皿中，用充足的Washing buffer室温下洗膜5min。封闭将尼龙膜放入1％封闭液中封闭30min，再在含1/5000的anti-Dig-AP的1％封闭液中封闭30min，然后用充足的Washing buffer室温下洗膜2次，每次15min。平衡将尼龙膜放入检测液中平衡3min。显色将尼龙膜放入显色液(1∶50检测液稀释)中，避光显色2h以上，观察并照相。
4.高产菌株的获得在MD平板上获得大量的PSY、PDS基因转化的红色的酵母菌株，其它未转化的菌株为白色，证明初步获得高表达量的红色酵母菌株。图为单菌株继代板。
通过继代筛选和6代的遗传稳定性观察表明，转基因酵母具有遗传稳定性。
5.HPLC定量分析转基因红酵母中类胡萝卜素含量称取1g菌体，加入12ml 2M HCl，浸泡40min，100℃ 4min，迅速冷却(冷水冲涮)。离心(50ml离心管10000rpm 10min)，洗涤沉淀，除去上清，每次5ml丙酮，分4次，共20ml，将沉淀洗入锥形瓶中，加入5ml石油醚，振摇1min，静置5min。将提取液转入盛有100ml 5％硫酸钠的分液漏斗中，用10ml丙酮-石油醚(v∶v＝3∶7)混合物洗涤锥形瓶，洗涤液转入分液漏斗中，重复上述操作1～3次，直到提取液无色，弃去下层水溶液，再用15ml 5％硫酸钠反复振摇洗涤，直到下层水溶液清亮。
将提取液通过盛有10g无水硫酸钠(吸水)的小漏斗，下接球形瓶，用大约4～5ml的石油醚分数次洗净分液漏斗和无水硫酸钠层内的色素，将提取液于旋转蒸发器上减压蒸发，温度为60℃(大约为10～30min)，当蒸发至大约1ml时，取下锥形瓶，用氮气吹干，立即加入1ml三氯甲烷定容，-20℃保存备用。
转基因酵母中的β-胡萝卜素含量以β-胡萝卜素标样为基准，做标准曲线。经HPLC测定后计算峰面积，经计算PDS转基因酵母产β-胡萝卜素为430ug/g(干菌体)；PSY转基因酵母产β-胡萝卜素为692.3-1290ug/g(干菌体)。
6.吸收峰试验配制β-胡萝卜素标准液，稀释终浓度至50ug/ml，点样(至少5点)，同时作标准曲线。放入石油醚预先饱和的层析缸中展开，剪下目的片段，放入装有5ml石油醚的具塞试剂管中，利用分光光度计测其提取液吸光度，作标准曲线图，计算目的样品溶液浓度。
取一定量的类胡萝卜素提取物，用丙酮配制类胡萝卜素回收溶液，用DU2501紫外分光光度计在350-600nm波长区域内做光谱扫描图，结果如图。由图可知，最大吸收峰在475nm左右，可见其主要产物并不是β-胡萝卜素。可得转基因酵母菌体的类胡萝卜素回收量为760ug/g(干菌体)，β-胡萝卜素回收量为230ug/g(干菌体)。
7.形态学观察转基因酵母以圆饼型为主，大小直径7～11um。在普通光学显微镜下细胞不呈红色，细胞内无红色颗粒出现。经美蓝染色后，形态如图8.转基因酵母类胡萝卜素的主要组份类胡萝卜素的分离主要是由于它们化学结构的不同而引起的。它们在有机溶剂中溶解度的差别，可通过薄层层析分离，TLC分离结果见图(展开剂为丙酮∶石油醚＝3∶7)。由图可知，转基因酵母产物主要由三种类胡萝卜素构成，这与HPLC结果基本吻合，类胡萝卜素薄层层析图。
转基因酵母(1)酵母的准备用酵母片、发酵粉、啤酒酵母等的酵母菌液在固体酵母培养基平板上(如YPD、MD)划线，20-32℃培养。挑取单菌落于液体培养基(如YPD、MD)中20-32℃培养，至OD600为0.1-3，离心收集菌体，无菌水重悬沉淀，反复洗涤两次。再用0.1-500ml，0.1-2mol/L山梨醇重悬沉淀一次，最后收集沉淀于离心管中，-70℃或4℃储存。
(2)外源基因片段的操作将三套分别来自枸杞(7个基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE)、龙胆(7个基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE)和龙胆的7个基因的修饰基因(编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基)等基因，分别制备成独自基因DNA片段和表达载体装载的基因片段来转基因。
①独自基因片段转化酵母分别将FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE等基因的表达区或包含表达区的DNA片段，不加任何修饰分别直接转化面包酵母、啤酒酵母、酵母片酵母等，获得目的基因的转基因酵母，通过基因组DNA水平的PCR检测、RNA水平的RT-PCR检测，都可以证明在面包酵母、啤酒酵母、酵母片酵母的基因组中有外源基因整合并表达。高压液项色谱分析(HPLC)，可检测出外源基因表达并生物合成类胡萝卜素。
②利用载体转化酵母分别将FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE等基因的表达区或包含表达区的DNA片段，与酵母穿梭载体重组，如穿梭载体pPIC3.5、pPIC9。获得目的基因的转基因酵母的穿梭载体，枸杞基因pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB、pPIC9-LycE，龙胆基因pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY1、pPIC3.5-PSY2、pPIC3.5-PSY3、pPIC3.5-PSY4、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB1、pPIC3.5-LycB2、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY1、pPIC9-PSY2、pPIC9-PSY3、pPIC9-PSY4、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB1、pPIC9-LycB2、pPIC9-LycE，龙胆修饰基因pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY1、pPIC3.5-PSY2、pPIC3.5-PSY3、pPIC3.5-PSY4、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB1、pPIC3.5-LycB2、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY1、pPIC9-PSY2、pPIC9-PSY3、pPIC9-PSY4、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB1、pPIC9-LycB2、pPIC9-LycE。
首先进行酵母表达载体的外源基因线性化，用限制性内切酶(如Bgl II)酶切酵母载体，进行基因线性化处理，只保留目的基因和有利于与酵母基因组整合的AOX的DNA片段，电击法转基因入酵母，通过外源基因两端的AOX片段，将目的基因整合到酵母染色体，细胞培养电击转化后的酵母，获得转基因酵母。
通过对转基因酵母基因组DNA水平的PCR检测、RNA水平的RT-PCR检测，都可以证明在面包酵母、啤酒酵母、酵母片酵母等的基因组中有外源基因整合并表达。高压液项色谱分析(HPLC)，可检测出外源基因表达并生物合成类胡萝卜素。
在固体培养基上获得大量的FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE等基因的各个基因转化的酵母菌株，有些白色的菌株是将酶分泌到胞外的，红色的菌株为胞内高表达菌株，PCR、RT-PDR等方法在转基因酵母中能够扩增出具有转入基因的特异括增基因片段，表明类胡萝卜素生物合成途径中相关酶的基因转入酵母基因组。图2为单菌株继代板。通过继代筛选和遗传稳定性观察表明，转基因酵母具有遗传稳定性。
权利要求
1.一种类胡萝卜素生物合成相关酶基因，其包括1)法尼脂焦磷酸合酶(FPS，farnesyl pyrophosphate synthase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的FPS，其碱基序列片段为ATT TGT ATA CGC AGG ACA GAG ATC2)牦牛儿牦牛儿焦磷酸合酶(GGPS，geranylgeranyl pyrophosphatesynthase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的GGPS，其碱基序列片段为ATG GTG GAT TCA TGG GTG GTT CAG3)八氢番茄红素合酶(PSY，phytoene synthase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的PSY，其碱基序列片段为ATG TCT ATT TGT ACG CTA TGG GTC4)八氢番茄红素脱氢酶(PDS，phytoene desaturase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的ZDS，其碱基序列片段为ATG TCT CAA TTG GGA CAC ATA TCC5)ζ-胡萝卜素脱氢酶(ZDS，zeta-carotene desaturase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的ZDS，其碱基序列片段为ATG TCT TGT TCT TCT GCT TCT CTC6)番茄红素β-环化酶(LycB，β-Lycopene cyclase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的LycB，其碱基序列片段为ATG GAT ACT TTA GTG AAA ACT CCC7)番茄红素ε-环化酶(LycE，ε-Lycopene cyclase)基因，基因编码起始点第24个碱基处，替换单个碱基修饰的LycB，其碱基序列片段为ATG GAG TGT TTC AAA GTT CGA AAG
2.一种类胡萝卜素重组酵母载体，其特征在于利用FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE基因的PCR产物，连接到T-载体，再与酵母穿梭载体连接，构建重组酵母载体pPIC3.5-FPS、pPIC3.5-GGPS、pPIC3.5-PSY、pPIC3.5-ZDS、pPIC3.5-PDS、pPIC3.5-LycB、pPIC3.5-LycE、pPIC9-FPS、pPIC9-GGPS、pPIC9-PSY、pPIC9-ZDS、pPIC9-PDS、pPIC9-LycB、pPIC9-LycE。
3.一种类胡萝卜素自由基因转基因方法，其特征在于取酵母感受态细胞分别与FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE的表达区或包含表达区的DNA片段混匀，不加任何修饰分别直接转化，转移到电击杯中，电击后加入山梨醇，转移混合物到无菌的离心管，涂混合物在固体培养基平板上，直到产生单菌落，得到转基因酵母。
4.一种类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，其特征在于是含有外源类胡萝卜素生物合成相关酶基因FPS、GGPS、PSY、ZDS、PDS、LycB、LycE。
5.根据权利要求4所述的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，其特征在于类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母可以生物合成类胡萝卜素。
6.根据权利要求4所述的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，其特征在于可以生物合成一种使类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母体细胞呈圆形的蛋白-YRP。
7.根据权利要求4所述的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，其特征在于可以生物合成一种使实验小鼠健康的蛋白-RHP。
8.根据权利要求4所述的类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母，其特征在于类胡萝卜素相关酶基因转基因酵母菌体。
全文摘要
一种类胡萝卜素相关酶基因、重组酵母载体及转基因方法和转基因酵母，属于生物技术领域，特别是涉及一种类胡萝卜素重组酵母载体及转基因酵母。本发明主要是将类胡萝卜素合成途径中相关酶基因导入酵母表达载体中。通过DNA重组，将类胡萝卜素合成酶基因导入酵母中。检测特异基因在酵母中的表达。选择类胡萝卜素含量高的转基因酵母等。
文档编号C12N15/52GK1629294SQ20031011595
公开日2005年6月22日 申请日期2003年12月19日 优先权日2003年12月19日
发明者季静 申请人:季静