XJ－160病毒感染性全基因组cDNA克隆的制作方法

专利名称：XJ－160病毒感染性全基因组cDNA克隆的制作方法
技术领域：
本发明涉及一种XJ-160病毒的反向遗传学系统，特别是涉及XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆及其构建方法。
背景技术：
近二十年来随着反向遗传学技术的发展，RNA病毒的研究取得了重大突破。简单来说，反向遗传学技术就是首先利用逆转录PCR(RT-PCR)技术将病毒的RNA基因组转化为cDNA，然后在DNA水平上完成对RNA病毒基因组的操作，如进行人为修饰和改造等，最后利用体内/外转录技术或其它的方法将基因组cDNA转回到RNA状态，成为改造后新的病毒基因组，并最终利用宿主细胞获得具有目的表型的重组病毒。反向遗传学技术使研究人员对RNA病毒基因组的操作成为可能，大大方便了RNA病毒的研究。目前该技术已经广泛应用于各类RNA病毒的研究中，为研究RNA病毒的生命机理、致病机制和病毒与宿主细胞之间关系提供了关键的技术平台(1)。
感染性克隆是利用反向遗传学技术建立的一种反向遗传学系统，其表现形式是将RNA病毒的全长基因组cDNA克隆到一个载体中，获得一个稳定的含有全长基因组cDNA的克隆，利用这样的克隆转录得到新的病毒RNA基因组，从而实现对RNA病毒的操作。由于正链RNA病毒的RNA基因组可行使mRNA的功能，单一的裸露RNA即具有感染性的特性，使感染性克隆这种反向遗传学技术在正链RNA病毒的研究中应用更为普遍(2)。正链RNA病毒成员较多，分别属于小RNA病毒科、披膜病毒科、黄病毒科、杯状病毒科、冠状病毒科等，对于每一种病毒来说，其各种机理的阐明很大程度上得益于建立的感染性克隆。获得RNA病毒感染性cDNA克隆可以大大提高对RNA病毒研究的潜力，借助基因组感染性克隆可以进一步揭示病毒基因组的分子特征，使单个功能基因的研究不再是脱离病毒整体的孤立研究。从整个基因组水平来研究错综复杂、相互关联的病毒与宿主的关系具有独特的优势。RNA病毒感染性克隆也为新型病毒疫苗的研制和新型病毒载体的开发提供了极好的分子生物学研究工具。
披膜病毒作为一类正链RNA病毒，含有成员众多并主要集中在甲病毒属，在各大洲均有分布。甲病毒属包含一类导致严重脑炎的病毒如东部马脑炎病毒(Eastern EquineEncephalitis Virus，EEE)、西部马脑炎病毒(Western Equine Encephalitis Virus，WEE)和委内瑞拉马脑炎病毒(Venezuelan Equine Encephalitis Virus，VEE)和另一类引起发热、皮疹和关节炎的病毒如辛德毕斯病毒(Sindbis virus，SIN)、西门利克森林病毒(Semliki Foiestvirus，SFV)、罗斯河病毒(RossRiver virus，RR)等。其中SIN、SFV、RR、VEE等多种病毒株的感染性克隆的建立(3，4，5，6)及应用为甲病毒的基因功能、调控模式和病毒的致病机理的阐明提供了重要的研究手段。特别是辛德毕斯病毒作为披膜病毒科甲病毒属的代表病毒，在病毒形态、基因组结构、病毒复制等方面均集中表现了动物病毒的基本特性，成为研究动物病毒的模式病毒。辛德毕斯病毒感染性克隆在甲病毒的研究和开发中起着重要作用，而且来自不同地域的分离株的感染性克隆都将有利于从多角度充分揭示甲病毒的生命机理。
XJ-160病毒是我国于1990年首次分离的病毒，全基因组核苷酸序列测定(7)表明该病毒株具有典型的辛德毕斯病毒基因组结构，除5’帽子结构和3’polyA尾外，基因组全长总共11626个核苷酸，全序列已经录入GenBank(AF103728)。同源性分析表明该病毒株与目前国际上已知的辛德毕斯病毒株相比，其核苷酸和氨基酸的变异较大，提示XJ-160病毒为辛德毕斯病毒新亚型(8)。该XJ-160病毒已申请中国发明专利(申请号为98120692.1)。
为了从基因组水平研究XJ-160病毒与国外同类病毒的差异性，以及进一步深入阐明XJ-160病毒的复制机制和致病机理，为病毒性传染病的预防和控制提供理论依据，我们构建了XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆。

发明内容
本发明目的是提供XJ-160病毒感染性全基因组cDNA克隆，它包括XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆及其构建方法，还提供一种可作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆的骨架质粒以及用途。本发明是利用低拷贝质粒作骨架构建而成的，其克隆的稳定性好；该感染性克隆具有清晰的遗传学背景，感染性克隆来源的恢复病毒较好的重现了XJ-160病毒的各种生物学特征。
为达到上述目的本发明采用以下技术方案本发明中感染性cDNA克隆的构建方案是首先获得覆盖病毒基因组全长的cDNA片段，然后选择适合的克隆载体，将若干cDNA片段在载体上组装成病毒基因组全长cDNA；同时在病毒基因组序列5’端加上RNA聚合酶启动子序列，在3’端加上polyA尾序列和单一限制性内切酶识别序列；通过体外转录获得转录体RNA，然后转染到宿主细胞中，通过细胞病变、噬斑检测、间接免疫荧光等多项指标来检测转染RNA后是否产生恢复病毒。
本发明提供了一种XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，该克隆由骨架质粒pBR、含11620个碱基对的病毒基因组全长cDNA、基因组5’端的SP6启动子序列和基因组3’端的35个连续的A组成。其中所述的骨架质粒pBR由线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成；所述的病毒基因组全长cDNA由三个cDNA组装片段通过所述单酶切位点插入骨架质粒pBR组装而成，三个组装片段顺次连接，覆盖了XJ-160病毒的全长基因组；所述的SP6启动子序列位于基因组5’端上游紧邻第一个核苷酸A，所述的35个连续的A紧邻基因组3’末端核甘酸C。
其感染性全基因组cDNA的序列为1 ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATAGCACT51 ACCATCATAA TGGAGAGGCC TGTAGTTAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG101 TCCGTTTGTC GCTCAACTGC AAAAGAGCTT CCCGCAATTC GAGGTAGTAG151 CACAGCAGGC CACACCAAAT GACCATGCTA ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT201 CTGGCTAGTA AATTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG CGACGATTTT251 GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCACTATC301 ACTGCGTCTG CCCTATGCGG AGCCCCGAAG ATCCCGACCG TATGATGAAA351 TACGCCAATA AGTTGGCGGA GAAGGCAAAT AAGATTACTA ATAAAAATTT401 GCATGAGAAG ATTAAAGACC TCCGGATCGT ACTCGATACT CCGGATGCTG451 AGACACCGTC GCTCTGCTTC CATAATGACG TTACCTGCAG TACGCGTGCA
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10101 TCTACTAATC AAGAGTATAT CACCTGCAAG TTTACTACTG TAGTCCCCTC10151 CCCGAAAGTC AAATGTTGCG GCTCCTTGGA ATGTCAGCCC GCCGCTCACG10201 CCGACTATAA CTGCAAAGTT TTTGGAGGGG TTTACCCATT CATGTGGGGA10251 GGAGCACAGT GTTTTTGCGA CAGCGAGAAC ACCCAGATGA GCGAGGCGTA10301 CGTCAAACTG TCAGCGGACT GCGTAACGGA TTACGCACAG GCAGTTAAGG10351 TGCATACTGC TGCAATGAAG GTAGGACTAC GCATAGTGTA TGGGAATACC10401 ACCAGCTATT TAGATGTGTA CGTGAATGGA GTCACGCCGG GGACATCCAA10451 AGATCTAAAA GTCATAGCTG GGCCAGTTTC GTCCTCCTTT ACGCCGTTTA10501 ATCATAAGGT TGTCATCTAC CGTGGTTTAG TCTATAATTA TGACTTCCCT10551 GAATACGGCG CAATGAAACC TGGAGTGTTC GGAGACATCC AAGCTACCTC10601 CTTGACCAGT AGAGACCTTA TTGCAAGCAC GGACATTAGA TTGCTTAAGC10651 CTTCCGTTAA AAACGTGCAC GTCCCGTACA CGCAAGCTGC TTCAGGATTC10701 GAGATGTGGA AGAACAACTC AGGTCGACCA CTGCAGGAAA CCGCTCCTTT10751 TGGGTGTAAG ATTGCAGTCA ACCCGCTACG AGCGGTGGAC TGTTCGTACG10801 GTAATATTCC TATCTCCATC GATATCCCAA ATGCCGCCTT CATTAGGATA10851 TCGGATGCGC CGCTAGTTTC GACGGTTAAA TGTGAGGTCA GCGAATGTAC10901 CTATTCAGCT GATTTTGGTG GTATGGCAAC CCTGCAGTAT GTGTCGGACC10951 GCGAAGGACA ATGCCCCGTG CACTCTCACT CAAGCACAGC AACACTTCAG11001 GAATCGACAG TGCATGTCCT GGAGAAAGGG GCGGTGACCG TGCACTTTAG11051 TACCGCCAGC CCACAGGCTA ATTTCATTAT ATCGCTGTGT GGCAAGAAAA11101 CAACATGCAA CGCGGAATGT AAGCCACCTG CGGACCACAT TGTGAGTACA11151 CCGCACAAAA TCGATCAGGA GTTCCAAACC GCTATTTCAA AAACATCATG11201 GAGCTGGTTA CTGGCACTCT TTGGCGGCGC CTCGTCGCTA TTAATTATAG11251 GACTCATGAT TTTTACTTGC AGCATGTTGC TGACAAGCAC CCGGAGATGA11301 CCGCTATGTC CCAATGACCC GACCAGCAAA ACTCGACGTA TTTCCGAGGA11351 ACTGATGTGC ATAATGCATC AGGCTGGTAT ATTAGATCCC CGCTCATCGC11401 GGGCACTATA GCAACAATGA AACTCGATGT ATTTCCGAGG ATGCGCAGTG11451 CATAATGCTG CGCCGTGTTG CCATATAATC ATTTTATTAA TCAACTATTT11501 AGCAGACGCT AAAACTCAAT GTATTTCTGA GGAAGCGTGG TGCATAATGC11551 CATGCAGCGT CTGTATAATT TCTTTTATTA TTCTTTTATC AATTAACCAA11601 AATTTTGTTT TTAACATTTC AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA AAAAAAAAAA11651 AAAAACTCGA GCAATTCTTG AAGACGAAAG GGCCTCGTGA TACGCCTATT11701 TTTATAGGTT AATGTCATGA TAATAATGGT TTCTTAGACG TCAGGTGGCA11751 CTTTTCGGGG AAATGTGCGC GGAACCCCTA TTTGTTTATT TTTCTAAATA11801 CATTCAAATA TGTATCCGCT CATGAGACAA TAACCCTGAT AAATGCTTCA11851 ATAATATTGA AAAAGGAAGA GTATGAGTAT TCAACATTTC CGTGTCGCCC11901 TTATTCCCTT TTTTGCGGCA TTTTGCCTTC CTGTTTTTGC TCACCCAGAA11951 ACGCTGGTGA AAGTAAAAGA TGCTGAAGAT CAGTTGGGTG CACGAGTGGG12001 TTACATCGAA CTGGATCTCA ACAGCGGTAA GATCCTTGAG AGTTTTCGCC12051 CCGAAGAACG TTTTCCAATG ATGAGCACTT TTAAAGTTCT GCTATGTGGC12101 GCGGTATTAT CCCGTGTTGA CGCCGGGCAA GAGCAACTCG GTCGCCGCAT12151 ACACTATTCT CAGAATGACT TGGTTGAGTA CTCACCAGTC ACAGAAAAGC12201 ATCTTACGGA TGGCATGACA GTAAGAGAAT TATGCAGTGC TGCCATAACC12251 ATGAGTGATA ACACTGCGGC CAACTTACTT CTGACAACGA TCGGAGGACC12301 GAAGGAGCTA ACCGCTTTTT TGCACAACAT GGGGGATCAT GTAACTCGCC12351 TTGATCGTTG GGAACCGGAG CTGAATGAAG CCATACCAAA CGACGAGCGT12401 GACACCACGA TGCCTGCAGC AATGGCAACA ACGTTGCGCA AACTATTAAC12451 TGGCGAACTA CTTACTCTAG CTTCCCGGCA ACAATTAATA GACTGGATGG
12501 AGGCGGATAA AGTTGCAGGA CCACTTCTGC GCTCGGCCCT TCCGGCTGGC12551 TGGTTTATTG CTGATAAATC TGGAGCCGGT GAGCGTGGGT CTCGCGGTAT12601 CATTGCAGCA CTGGGGCCAG ATGGTAAGCC CTCCCGTATC GTAGTTATCT12651 ACACGACGGG GAGTCAGGCA ACTATGGATG AACGAAATAG ACAGATCGCT12701 GAGATAGGTG CCTCACTGAT TAAGCATTGG TAACTGTCAG ACCAAGTTTA12751 CTCATATATA CTTTAGATTG ATTTAAAACT TCATTTTTAA TTTAAAAGGA12801 TCTAGGTGAA GATCCTTTTT GATAATCTCA TGACCAAAAT CCCTTAACGT12851 GAGTTTTCGT TCCACTGAGC GTCAGACCCC GTAGAAAAGA TCAAAGGATC12901 TTCTTGAGAT CCTTTTTTTC TGCGCGTAAT CTGCTGCTTG CAAACAAAAA12951 AACCACCGCT ACCAGCGGTG GTTTGTTTGC CGGATCAAGA GCTACCAACT13001 CTTTTTCCGA AGGTAACTGG CTTCAGCAGA GCGCAGATAC CAAATACTGT13051 CCTTCTAGTG TAGCCGTAGT TAGGCCACCA CTTCAAGAAC TCTGTAGCAC13101 CGCCTACATA CCTCGCTCTG CTAATCCTGT TACCAGTGGC TGCTGCCAGT13151 GGCGATAAGT CGTGTCTTAC CGGGTTGGAC TCAAGACGAT AGTTACCGGA13201 TAAGGCGCAG CGGTCGGGCT GAACGGGGGG TTCGTGCACA CAGCCCAGCT13251 TGGAGCGAAC GACCTACACC GAACTGAGAT ACCTACAGCG TGAGCTATGA13301 GAAAGCGCCA CGCTTCCCGA AGGGAGAAAG GCGGACAGGT ATCCGGTAAG13351 CGGCAGGGTC GGAACAGGAG AGCGCACGAG GGAGCTTCCA GGGGGAAACG13401 CCTGGTATCT TTATAGTCCT GTCGGGTTTC GCCACCTCTG ACTTGAGCGT13451 CGATTTTTGT GATGCTCGTC AGGGGGGCGG AGCCTATGGA AAAACGCCAG13501 CAACGCGGCC TTTTTACGGT TCCTGGCCTT TTGCTGGCCT TTTGCTCACA13551 TGTTCTTTCC TGCGTTATCC CCTGATTCTG TGGATAACCG TATTACCGCC13601 TTTGAGTGAG CTGATACCGC TCGCCGCAGC CGAACGACCG AGCGCAGCGA13651 GTCAGTGAGC GAGGAAGCGG AAGAGCGCCT GATGCGGTAT TTTCTCCTTA13701 CGCATCTGTG CGGTATTTCA CACCGCATAT GGTGCACTCT CAGTACAATC13751 TGCTCTGATG CCGCATAGTT AAGCCAGTAT ACACTCCGCT ATCGCTACGT13801 GACTGGGTCA TGGCTGCGCC CCGACACCCG CCAACACCCG CTGACGCGCC13851 CTGACGGGCT TGTCTGCTCC CGGCATCCGC TTACAGACAA GCTGTGACCG13901 TCTCCGGGAG CTGCATGTGT CAGAGGTTTT CACCGTCATC ACCGAAACGC13951 GCGAGGCAGC TGCGGTAAAG CTCATCAGCG TGGTCGTGAA GCGATTCACA14001 GATGTCTGCC TGTTCATCCG CGTCCAGCTC GTTGAGTTTC TCCAGAAGCG14051 TTAATGTCTG GCTTCTGATA AAGCGGGCCA TGTTAAGGGC GGTTTTTTCC14101 TGTTTGGTCA CTGATGCCTC CGTGTAAGGG GGATTTCTGT TCATGGGGGT14151 AATGATACCG ATGAAACGAG AGAGGATGCT CACGATACGG GTTACTGATG14201 ATGAACATGC CCGGTTACTG GAACGTTGTG AGGGTAAACA ACTGGCGGTA14251 TGGATGCGGC GGGACCAGAG AAAAATCACT CAGGGTCAAT GCCAGCGCTT14301 CGTTAATACA GATGTAGGTG TTCCACAGGG TAGCCAGCAG CATCCTGCGA14351 TGCAGATCCG GAACATAATG GTGCAGGGCG CTGACTTCCG CGTTTCCAGA14401 CTTTACGAAA CACGGAAACC GAAGACCATT CATGTTGTTG CTCAGGTCGC14451 AGACGTTTTG CAGCAGCAGT CGCTTCACGT TCGCTCGCGT ATCGGTGATT14501 CATTCTGCTA ACCAGTAAGG CAACCCCGCC AGCCTAGCCG GGTCCTCAAC14551 GACAGGAGCA CGATCATGCG CACCCGTGGC CAGGACCCAA CGCTGCCCGA14601 GAGCTCGATT TAGGTGACAC TATAG其中1-11620 病毒核苷酸序列11621-11655 polyA序列11656-11661 XhoI酶切位点11656-14606 pBR骨架质粒序列14601-14606 SaCI酶切位点
14607-14625 SP6启动子序列本发明提供了能够保证全长基因组cDNA克隆在宿主细胞内稳定性的骨架质粒。由于基因组cDNA在低拷贝克隆载体中稳定，所以本发明选用低拷贝质粒pBR322来制备适用于本发明的骨架质粒。本发明中用一对互补寡核苷酸退火形成的连接子替换pBR322质粒中的EcoR I-Ava I片段(86-1268nt)，去除质粒中的Tetr基因，得到骨架质粒。具体步骤包括首先将pBR322质粒线性化，然后将线性化后的质粒与含单酶切位点的连接子用本领域常规方法连接制得骨架质粒。
在本发明的一个具体实施方案中，是用EcoR I和Ava I双酶切除去质粒pBR322中四环素抗性基因Tetr，得到2934bp的线性化的质粒。
本发明中将XJ-160病毒的基因组分成三个组装片段进行组装，因此，本发明中所述的连接子中设计含有单酶切位点，以便利用相应酶切位点将病毒基因组引入骨架质粒中。
在本发明的一个具体实施方案中，所述的连接子由两个互补的寡核苷酸片段SX-和SX+经退火获得，其中SX-和SX+的序列分别为SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’；SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’寡核苷酸片段SX-和SX+退火后生成的连接子中含有单酶切位点Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I，该连接子长度为61bp，末端为粘性末端，分别与用EcoR I和Ava I酶切后得到的2934bp的线性化质粒的粘性末端互补。
在本发明的一个具体实施方案中，将得到的2934bp的线性化质粒和61bp的连接子用本领域常规方法连接得到构建感染性cDNA克隆使用的骨架质粒，本发明中命名为pBR。
本发明中以三个cDNA组装片段的方式将XJ-160病毒病毒全基因组cDNA引入到骨架质粒中。XJ-160病毒基因组全长11626个核苷酸，本发明中将基因组8453位核苷酸C突变为T，产生Xba I单酶切位点(8451-8456 TCCAGA→T↓CTAGA)，结合位于基因组2517位的BamHI单酶切位点，将XJ-160病毒全基因组序列分为NS1(1-2516nt)、6K(2517-8451nt)和S2(8452-11626nt)三个组装片段。在病毒基因组cDNA序列5’端上游紧邻第一个核苷酸A引入SP6启动子序列和Sac I酶切位点，SP6用于以起始病毒RNA的转录，Sac I用于片段组装；在病毒基因组3’末端核苷酸C后引入polyA序列(35个A组成)和一个单酶切位点Xho I，Xho I用于线性化全基因克隆质粒制备体外转录模板。引入的Xba I酶切位点作为全基因克隆的遗传标记，用于鉴别恢复病毒的来源。利用Sac I、BamHI、Xba I和Xho I四个酶切位点，将病毒全基因组分为三片段，以pBR质粒作骨架进行全长cDNA片段组装。
另一方面，本发明提供了骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆的载体的用途。
在本发明的一个具体实施方案中，本发明所述的骨架质粒pBR作为制备XJ-160病毒病毒全长基因组感染性cDNA克隆的载体。
另一方面，本发明还提供了一种XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，该方法包括(1)从感染XJ-160病毒的小鼠脑组织提取RNA；(2)用三对引物通过RT-PCR扩增，得到覆盖病毒基因组全长的三个cDNA组装片段；(3)制备上述三个cDNA组装片段的T载体克隆；(4)经亚克隆操作构建得到XJ-160病毒的全长基因组cDNA克隆；(5)体外转录制备病毒基因组全长RNA；(6)用脂质体转染的方法将上述全长RNA导入哺乳动物细胞；(7)收取含恢复病毒的细胞上清；(8)对恢复病毒进行遗传标记的鉴定；(9)比较恢复病毒与亲本病毒的生物学特性。
其中病毒RNA的提取和RT-PCR的操作均采用本技术领域的常规方法。
从cDNA克隆合成感染性转录体，有效的RNA聚合酶启动子是必须的。本发明选用噬菌体启动子SP6，合成的引物Sp6f2中包含有SP6启动子序列。
制备上述三个cDNA组装片段的T载体克隆，简而言之，包括下述步骤(1)制备含有下列成分的反应体系pGEMT载体、PCR产物(NS1、6K或S2)、T4 DNA连接酶和连接缓冲液，4℃连接过夜；(2)将连接产物转化入感受态细胞；(3)筛选出阳性克隆(pGEMT-NS1、pGEMT-6K和pGEMT-S2)，用于下列亚克隆操作。
病毒基因组全长cDNA片段的亚克隆操作，包括下述步骤(1)Xba I/Xho I双酶切pGEMT-S2质粒和pBR骨架质粒，得到S2片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I双酶切pGEMT-6K质粒和pBR-S2质粒，得到6kb片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I双酶切pGEMT-NS1质粒和pBR-6K-S2质粒，得到NS1片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-NS1-6K-S2，该质粒即为XJ-160病毒全基因组cDNA克隆质粒，命名为pBR-XJ160。
获得RNA转录体是鉴定全基因克隆感染性的必须步骤。首先制备符合转录要求的完全线性化的质粒DNA模板，然后用SP6RNA聚合酶合成5’端带帽子结构的RNA转录体。步骤包括(1)酶切使全基因组质粒线性化制备转录模板，在本发明的具体实施方案中，使用XhoI酶切全基因组质粒成线性；(2)制备RNA转录体，在本发明的具体实施方案中，使用mMESSAGE mMACHINETMtranscription SP6 Kit(Ambion)，具体操作在厂商推荐方法基础上稍作改动。
使用脂质体转染方法，将RNA转录体导入哺乳动物细胞。本发明的具体实施方案中使用的哺乳动物细胞是BHK细胞。
将转染后的哺乳动物细胞按本领域常规方法进行培养，当细胞出现明显病变且超过80％时收获细胞及其上清，冻存备用，该病毒为第一代恢复病毒；冻存前，吸取上清重复上述培养操作得到第二代恢复病毒，依此类推。全基因克隆来源的病毒称作恢复病毒(BR-XJ160)。
为了区分恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒XJ-160，需要对获得的病毒进行遗传标记的鉴定。在本发明的具体实施方案中，在构建全基因组cDNA克隆时在基因组8453nt引入一个碱基突变(C→T)，创建出Xba I酶切识别序列(8451-8456 TCCAGA→T↓CTAGA)，所以用Xba I消化来自两种病毒的RT-PCR产物，对酶切结果进行比较。
为了鉴定本发明制备的感染性全基因组cDNA克隆是否可作为理想的反向遗产学系统，对感染性全基因组cDNA克隆pBR-XJ160的稳定性进行了鉴定，并对感染性克隆来源的恢复病毒(BR-XJ160)与亲本病毒XJ-160的多项生物学特性进行了比较。恢复病毒和亲本病毒的生物学性状表明在细胞病变效应、病毒的抗原性、病毒颗粒的形态、病毒噬斑形态和病毒在宿主细胞生长动力以及病毒毒力等方面没有明显的区别。感染性克隆来源的恢复病毒(BR-XJ160)较好的重现了XJ-160病毒的各种生物学特征。其中包括(1)pBR-XJ160克隆质粒在宿主菌中多次传代后，经限制性内切酶消化，各代质粒的酶切图谱不变，表明了该克隆的传代稳定性；各代克隆质粒的RNA转录体转染宿主细胞后均可产生恢复病毒，表明克隆的感染性是稳定的。(2)用间接免疫荧光测定法(9)鉴定病毒的抗原性。(3)电镜负染观察病毒颗粒。(4)用标准的噬斑检测方法(9)检测病毒在宿主细胞上形成的空斑。(5)用噬斑法检测病毒在感染培养的哺乳动物细胞后，于不同时间细胞上清中产生的子代病毒的滴度，用滴度的对数绘制曲线。(6)在乳鼠的脑组织接种病毒，检测病毒的致病能力。
所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆的载体的用途，上述的RNA病毒为披膜病毒科(Togaviridae)病毒或者是为甲病毒属(Alphavirus)病毒或者是辛德毕斯病毒(Sindbis virus)。


图1低拷贝骨架质粒pBR的构建2.XJ-160病毒全基因克隆构建策略3组装片段的RT-PCR电泳中1 DL15000 2 NS1 36K 4 S2 5DL15000图4全基因克隆pBR-XJ160构建过程5间接免疫荧光检测恢复病毒和XJ-160病毒感染的BHK细胞中A恢复病毒(BR-XJ160)B正常BHK细胞(阴性对照)C XJ-160病毒(阳性对照)图6恢复病毒(BR-XJ160)的遗传标记鉴定中A遗传标记分析示意图B遗传标记的琼脂糖凝胶电泳分析图7全基因克隆pBR-XJ160质粒的稳定性分析中A→H8次传代DH5α菌提取质粒经Sac I/Xho I双酶切产生11.6kb和2.9kb片段图8恢复病毒(BR-XJ160)与亲本病毒XJ-160的噬斑比较中A恢复病毒(BR-XJ160)B XJ-160病毒图9电镜观察XJ-160病毒和恢复病毒(BR-XJ160)的形态图(负染色)图中A恢复病毒(BR-XJ160)(×69000×2)B XJ-160病毒(×69000×2)注箭头所示病毒颗粒的放大图像位于右上图10恢复病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒在BHK细胞中的生长动力曲线本发明的优点本发明涉及的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆pBR-XJ160是利用低拷贝质粒作骨架构建而成的，克隆的稳定性好；在基因组cDNA克隆过程中引入了遗传标记有利于区分恢复病毒和亲本病毒；同时由于引入的遗传标记突变位点并未影响全基因克隆的感染性，为今后在感染性克隆进行基因突变研究提供了借鉴。该感染性克隆具有清晰的遗传学背景，感染性克隆来源的恢复病毒较好的重现了XJ-160病毒的各种生物学特征。本发明的感染性克隆作为有效的XJ-160病毒的反向遗传学系统，可在XJ-160病毒的进一步研究和开发中用作分子生物学工具。
具体实施例方式
一、低拷贝骨架质粒pBR的构建选择低拷贝质粒pBR322(TaKaRa公司)作为全基因克隆的骨架质粒。但要对pBR322质粒进行改造，使其成为适合本研究所用的工作质粒pBR。用一对互补的寡核苷酸退火形成的连接子替换pBR322质粒中的EcoR I-Ava I片段(86-1268nt)，去除质粒中的Tet基因，构建成只含有氨苄青霉素抗性的质粒，作为病毒全基因组cDNA克隆的骨架质粒(见图1)。
1、合成一对互补的寡核苷酸(上海生工)，进行等摩尔退火反应，获得连接子片段寡核苷酸SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’，SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’。
退火反应条件20ul体系47uM SX-，9ul，47uM SX+9ul，0.1MNaCl 0.2ul混匀，放于95℃水浴中，关闭水浴锅电源，使温度自然降至室温，即可使用。
2、骨架质粒pBR的获得用EcoR I和Ava I双酶切消化pBR322质粒，回收得到2934bp的线性质粒。酶切反应参照各内切酶说明书(Promega公司和TakaRa公司)。依次在1.5mlEppendof管内加入DNA、10x相应缓冲液和内切酶EcoR I和Ava I，用ddH2O补充到总体积20ul，37℃消化2小时，取3ul反应液于0.8-1％的琼脂糖凝胶中，进行100W恒压水平电泳，紫外灯下观察酶切结果。
利用T4 DNA连接酶将2934bp的线性质粒和上述得到的61bp的连接子进行连接，连接产物转化DH5α感受态细胞，经克隆筛选后得到骨架质粒pBR。
所得质粒pBR的核甘酸序列中消除了pBR322原有EcoR I位点，而将EcoR I位点移至多克隆位点(连接子)中。多克隆位点含有单酶切位点Sac I，Hind III，BamH I，SphI，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I，Xho I。这些单酶切位点用于病毒全基因cDNA克隆的构建。
二、XJ-160病毒全长基因组cDNA合成和克隆1.克隆构建策略(见图2)XJ-160病毒基因组全长11626个核苷酸，将基因组8453位核苷酸C突变为T，产生XbaI单酶切位点(8451-8456 TCCAGA→T↓CTAGA)，结合位于基因组2517位的BamH I单酶切位点，将XJ-160病毒全基因组序列分为NS1(1-2516nt)、6K(2517-8451nt)和S2(8452-11626nt)三个片段进行拼接组装。在病毒基因组cDNA序列5’端上游紧邻第一个核苷酸A引入SP6启动子序列和Sac I酶切位点，SP6用于以起始病毒RNA的转录，Sac I用于片段组装；在病毒基因组3’末端核苷酸C后引入polyA序列(35个A组成)和一个单酶切位点Xho I，Xho I用于线性化全基因克隆质粒制备体外转录模板。引入的Xba I酶切位点作为全基因克隆的遗传标记，用于鉴别恢复病毒的来源。利用pBR质粒作骨架，将病毒全基因组分为三片段，利用Sac I、BamH I、Xba I和Xho I四个酶切位点进行全长cDNA片段组装。
2.病毒培养及病毒RNA提取取-80℃贮存的经三轮单斑纯化后保存在冻干鼠脑悬液中的XJ-160病毒，将毒种接种乳鼠脑组织进行病毒扩增，用TriZol液(Invitrogen)从感染病毒的脑组织中提取病毒RNA(操作方法参见厂商说明书)。
3.RT-PCR获得病毒cDNA片段利用反转录试剂盒SUPERSCRIPTTMFirst-Strand Synthesis System for RT-PCR(Invitrogen公司)和PCR试剂盒Expand High fidelity PCR System(Roche公司)进行病毒基因组全长cDNA组装片段的扩增(操作方法参见生产商提供的说明书)。
cDNA片段扩增条件94℃预变性5min；94℃ 30 Sec，55℃ 30 Sec，72℃3min，30个循环，72℃延伸10mincDNA片段的电泳结果见图3。
表1 XJ-160病毒基因组cDNA片段扩增所用引物引物 引物序列a扩增片段bSp6f2 cgagctcgatttaggtgacactatagATTGACGGCGTAGTACACACTATTG SacI-BamHI(NS1)1-25nt (Sac I)BamR2 CTTGCAGGGGTTTGTAGTCTTCAT2699nt-2676ntP5 CGGGATCCTAAGCAGTGTGG2514nt-2533nt(BamH I) BamH I-XbaI(6K)XbR CTCTaGATGGTTCGCGGGTG8457nt-8438ntXbF CATCtAGAGCGTTAGATATCCTG 8449nt-8471nt(Xba I)Xba I-Xho I(S2)X2 ccgctcgagTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGGTTAATTG 11626nt-11596nt(Xho I)a大写字母表示病毒序列，小写字母表示非病毒序列，下划线代表限制性内切酶识别序列b用于构建全长克隆的cDNA片段见图2c斜体小写字母表示SP6启动子序列4.三个组装片段的T载体克隆PCR产物与pGEMT载体的连接反应体系10ul5ul快速连接缓冲液，1ulpGEMT载体，3ul PCR产物和1ul T4 DNA连接酶。混匀后，置于4℃连接过夜。
转化连接产物取上述连接产物5ul加入100ulDH5α感受态细胞内，置冰浴60min后，42℃热休克90秒，再置冰浴数分钟，加入无氨苄青霉素的LB约0.7ml，在37℃摇床150rpm摇菌60min；取200ul菌液加入40ul X-gal及4ul IPTG，混匀后涂含氨苄青霉素(100ug/ml)LB琼脂平板，于37℃倒置培养约14-16小时，直到可见清晰的蓝色和白色菌落。挑取白色菌落摇菌、提取质粒、进行酶切鉴定。
每一个PCR产物至少获得三个独立的T-A克隆(插入方向不同，或来自不同的转化试验)。
5.病毒基因组全长cDNA组装的亚克隆操作利用NS1、6K、S2片段组装成全基因组cDNA，构建过程(见图4)(1)Xba I/XhoI双酶切pGEMT-S2质粒和pBR骨架质粒，得到S2片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I双酶切pGEMT-6K质粒和pBR-S2质粒，得到6kb片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I双酶切pGEMT-NS1质粒和pBR-6K-S2质粒，得到NS1片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-NS1-6K-S2，该质粒即为XJ-160病毒全基因组cDNA克隆质粒，命名为pBR-XJ160。
DNA片段的克隆操作参见冷泉港第三版《分子克隆》(10)。
三、全基因组cDNA克隆的感染性鉴定1.体外转录制备病毒基因组全长RNA制备转录模板用Xho I单酶切全基因质粒pBR-XJ160，酶切反应体系50ul10×缓冲液5ul，pBR-XJ160质粒20ug，Xho I酶50IU，用ddH2O补足至50ul，混匀。37℃水浴至少3小时，取少许反应液进行电泳，鉴定酶切是否完全。加入5％SDS和1/10体积的蛋白酶K(20mg/ml)，于50℃水浴至少30分钟，用等体积酚氯仿抽提一次，然后加入1/10体积的5M醋酸铵和2倍体积的无水乙醇沉淀线性质粒DNA，4℃10000rpm离心10分钟，弃上清，室温干燥，用无RNase的ddH2O溶解使其浓度为0.5ug/ul。
制备RNA转录体用mMESSAGE mMACHINETMtranscription SP6 Kit(Ambion)完成体外转录。反应体系20ulNuclease-free water2ul，2×NTP/Cap10ul，10×Reaction Buffer2ul，20mMGTP2ul，线性全基因质粒(0.5ug/ul)2ul，Enzyme Mix 2ul。混匀后于37℃水浴2小时，然后取1ul反应液加入3ul上样缓冲液混匀，于85℃水浴3-4min，取出后置于冰上，进行琼脂糖凝胶电泳鉴定RNA的合成效率。
转录体RNA的纯化在反应液中加入1ul Nuclease-free的DNase I，于37℃水浴15min，去除质粒DNA模板；然后加入30ul Nuclease-free water和25ul 2.5MliCl，混匀后置于-20℃，沉淀RNA，至少30min；4℃10000rpm离心15分钟，弃上清，用70％乙醇(DEPC处理的去离子水配制)洗涤一次，离心弃上清，室温干燥，用无RNase的ddH2O溶解至适当体积，用分光光度计检测RNA的浓度，然后分装后于-70℃贮存。一般含有1ug线性化模板DNA的20ul反应体系可产生大约20ugRNA。
2.将转录体RNA转染哺乳动物细胞在35mm细胞培养皿中接种105BHK细胞，37℃孵育24-48小时待细胞生长至50-80％融合时用于RNA转染。转染操作过程(1)弃去细胞上清，用无血清Eagle’s培养液洗涤细胞一次；(2)配制脂质体-RNA复合物首先在无RNase的Ependorf管中加入1ml无血清无抗生素的Eagle’s培养液，然后加入转染试剂DMRIE-C(GiBcol公司)10ul，在振荡器上振荡混匀，最后加入约5ug纯化的转录体RNA，在振荡器上充分混匀；(3)立刻将脂质体-RNA复合物转移至洗涤好的BHK-21细胞上，于37℃5％CO2孵箱中孵育4-5小时；(4)弃去转染上清，更换Eagle’s完全培养基2.5ml(含10％小牛血清，2％青霉素链霉素，1％谷氨酰胺)，37℃5％CO2继续孵育，逐日观察细胞变化。该实验设立阴性对照为步骤(2)不加RNA，其它条件相同。
在转染转录体RNA后12h、24h、36h、48h、60h、72h六个时间点连续观察细胞变化。当细胞完全病变时，收获细胞和上清冻存于-20℃。
用10ul脂质体DMRIE-C包裹约5ugRNA转染大约105个BHK细胞(在35mm培养皿中细胞生长达70-80％)，在转染后24小时即可在显微镜下观察到细胞病变效应，但不是很明显，只有很少量的细胞呈现圆缩，其折光所产生的表象与XJ-160病毒导致的BHK细胞病变极为相似，这些细胞在显微镜视野中成灶状分布，随时间发展这种圆缩的细胞越来越多；转染48小时后细胞呈现明显的细胞病变，几乎80％的细胞呈现圆缩，有少许细胞开始脱落。而没有转染转录体RNA的阴性对照细胞形态一直保持良好。
3.恢复病毒扩增和定量当大方瓶中的单层BHK细胞长到80-90％融合成片时，弃去培养液，用Eagle’s培养液洗涤一次，加入0.2ml转染转录体RNA后的细胞上清，用Eagle’s培养液补足到1ml，置于37℃5％CO2孵箱中使病毒充分吸附细胞，吸附1小时后弃去吸附上清，加入10ml维持液(含2％小牛血清的Eagle’s培养液)，于37℃5％CO2孵箱中孵育，连续观察细胞变化。当细胞出现明显病变且超过80％时收获细胞，冻存于-20℃，该病毒视为第一代恢复病毒。在冻存之前，吸取上清0.2ml，继续上述过程，得到第二代恢复病毒。同样的方法由第二代恢复病毒传代得到第三代恢复病毒，将恢复病毒的第三代病毒作为鉴定恢复病毒生物学特性的后续实验毒种，以200ul为单位将第三代恢复病毒细胞上清分装贮存于-70℃冰箱。
噬斑法测定恢复病毒滴度选择生长良好融合成片的单层BHK细胞(六孔细胞培养板)，用Eagle’s培养液洗涤细胞一次；将需测定的病毒悬液作10倍系列稀释(10-1-10-10)，在每个培养孔分别接种各稀释度(根据检测的病毒选择稀释度范围10-4-10-8或10-5-10-9)的病毒悬液0.5ml，同时设不含病毒的Eagle’s培养液的空白对照，于37℃孵育吸附1小时，弃掉吸附病毒液，用Hank’s液洗涤一次，覆盖含1％低熔点琼脂糖的固体培养基(含4％小牛血清的2×Eagle’s培养液与等体积2％低熔点琼脂糖混合配制而成)，于37℃5％CO2孵箱中孵育，连续观察细胞变化；当在显微镜下可以观察到局部区域出现明显细胞病变时覆盖第二层含0.3％中性红(Sigma公司)的固体培养基，于37℃5％CO2孵箱继续培养，约6个小时后观察空斑的形态并计算每个细胞孔的噬斑数量。病毒滴度计算每孔噬斑数/接种的病毒悬液体积×稀释度。
当细胞病变接近完全时，同时收获对照细胞和转染RNA细胞的上清，在BHK细胞连续传代三次，后者在三次传代细胞中均出现典型的细胞病变，前者均未出现任何细胞病变。对转染RNA后的细胞上清以及三次传代细胞上清进行了病毒滴度检测，结果见表2。当恢复病毒传第三代后病毒的滴度基本达到XJ-160病毒的水平(108PFU/ml)。
表2恢复病毒滴度检测细胞上清 病毒滴度(PFU/ml)转染RNA细胞 1.5×107传第一代细胞 2×107传第二代细胞 5×107传第三代细胞 2.6×108上述结果提示以全基因克隆pBR-XJ160作为模板合成的转录体RNA具有感染性，转染BHK细胞后可产生病毒。将全基因克隆来源的病毒称作恢复病毒，命名为BR-XJ160。
4.间接免疫荧光测定法(IFA)鉴定病毒的抗原性IFA操作过程(1)用PBS洗涤玻璃片一次，用冷丙酮固定15分钟，吹干；(2)滴加50ulXJ-160病毒小鼠免疫腹水(效价1∶1240，1∶100稀释)(本室自制)，37℃湿盒作用30分钟，PBS冲洗2-3次，吹干；(3)滴加50ul FITC标记的羊抗小鼠抗体(1∶100稀释原液)，37℃湿盒作用30分钟，PBS冲洗3次；(4)用90％甘油封片，荧光显微镜下观察。
为了鉴定来自全基因克隆的恢复病毒(BR-XJ160)的抗原性，分别用恢复病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒感染BHK细胞，感染后24小时细胞完全病变时用抗XJ-160病毒的小鼠免疫血清进行间接免疫荧光检测(IFA)。结果显示两种病毒感染的细胞均表现出相同的荧光(见图5)。该结果提示恢复病毒(BR-XJ160)具有与XJ-160病毒相同的抗原性。
5.恢复病毒(BR-XJ160)的遗传学鉴定为了区分恢复病毒和亲本病毒XJ-160，在构建XJ-160病毒的全基因克隆时在基因组8453nt引入一个碱基突变(C→T)，创建出Xba I酶切识别序列(8451-8456 TCCAGA→TCTAGA)，将该酶切位点作为XJ-160病毒感染性克隆的遗传标记(见图2)。将转染转录体RNA后的细胞上清和亲本病毒分别感染BHK细胞，待出现明显的细胞病变后，分别收获细胞，提取细胞总RNA。利用RT-PCR方法扩增病毒基因组含有Xba I位点(8451-8456nt)的基因片段(7567-9821nt，2255bp)。用Xba I消化来自两种病毒的RT-PCR产物，应得到不同的酶切结果(见图6A)。
上游引物7568f(5’GGATCCACTATGAATAGAGGATTC 3’7567-7584nt)下游引物E3-E2r(5’TTACGGTACCGTAGCGTTAGCCGATCTAATGC 3’9821-9802nt)。
将Xba I酶消化后的RT-PCR产物，在1％琼脂糖凝胶上进行电泳分析。
电泳结果(见图6B)显示恢复病毒的RT-PCR产物可被Xba I酶切产生885bp和1368bp两条片段，而XJ-160病毒的PCR产物不能被Xba I酶切割为两片段。这一结果明确了恢复病毒(BR-XJ160)来自全基因克隆pBR-XJ160，由其感染性全长RNA转录体转染细胞后得到，而不是受亲本病毒XJ-160污染所致。
6.具有感染性的全基因克隆的遗传稳定性鉴定将经鉴定具有感染性的全基因克隆质粒转化宿主菌E.coli DH5α，挑单菌落接种Amp+LB液体培养基，37℃摇菌12小时，碱裂解法提取质粒，作为第一次扩增的质粒；将第一次扩增质粒的菌液以1∶1000稀释后转接，摇菌12小时，提取质粒作为第二次扩增的质粒；依此类推，这样连续得到8次扩增的质粒。每一次质粒扩增相当于复制20代。将8次扩增所得质粒同时用Sac I/Xho I双酶切消化2-3小时，于0.8％琼脂糖凝胶电泳，观察8次扩增质粒的酶切图谱是否有变化。
结果显示8代质粒的酶切图谱完全相同，Sac I/Xho I双酶切pBR-XJ160质粒得到长11.6kb的全长基因组cDNA片段和2.9kb载体片段(见图7)。这些结果提示该全基因克隆pBR-XJ160质粒在DH5α宿主菌中可以稳定传代。
用第8次扩增的全基因克隆质粒制备转录模板，经体外转录获得转录体RNA，在经脂质体转染BHK细胞后48小时即可观察到细胞圆缩、脱落等细胞病变效应。将转染后的细胞上清再次感染BHK细胞，24小时后细胞完全病变。以上结果表明全基因克隆pBR-XJ160质粒的感染性也是稳定的。
四、恢复病毒(BR-XJ160)的生物学性状鉴定1.病毒在BHK细胞上的空斑病毒的噬斑检测方法上面已有描述。
对恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒XJ-160在BHK细胞上形成的空斑进行比较，结果发现在长满BHK细胞的35mm培养皿中分别感染100pfu病毒后约48小时均形成清晰可见的病毒噬斑，二者的形状大小没有明显的区别。见图82.电镜观察病毒形态电镜负染色检查操作(1)取感染病毒后细胞完全病变的细胞上清20ul滴于石蜡膜上，将铜网反扣于上清上约10min；(2)吸取20ul磷钨酸负染试剂滴于石蜡膜上，将铜网再反扣于负染试剂上约10min；(3)取下铜网，室温晾干，即可通过透射电镜观察病毒形态。
电镜负染色观察恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒的形态在XJ-160病毒和恢复病毒感染的细胞上清中，负染色均可以观察到病毒颗粒，多呈圆形，外周可见到排列整齐的棘突，直径大约在60-80nm之间(N＞10)。两种病毒颗粒在形态上没有明显的区别。见图93.病毒的生长动力检测取已知病毒滴度的亲本病毒和恢复病毒，以0.01mol感染单层BHK细胞，每一种病毒平行试验三孔。分别于感染后4h、8h、12h、16h、20h、24h、30h、36h吸取细胞上清，用噬斑法测定各时间点的细胞上清的病毒滴度，计算每个时间点上清病毒滴度的平均值，绘制病毒感染BHK细胞后的生长动力曲线。
感染病毒后连续观察细胞病变，两种病毒产生的细胞病变过程和程度基本相同于感染后12小时可见到零星的细胞出现圆缩、突起和细胞折光改变；于感染后16小时局部细胞呈现较明显的细胞病变效应(CPE)；20小时细胞呈现典型的细胞病变效应；24小时细胞几乎全部病变。对不同时间点的细胞上清样品进行病毒滴度测定显示两种病毒在BHK细胞中的生长动力曲线是相似的(见图10)。以上结果提示恢复病毒和亲本病毒在BHK细胞中的复制能力和播散能力没有显著区别。
4.病毒对乳小鼠的致病性用保存于-70℃的第三代恢复病毒(BR-XJ160)和XJ-160病毒，对出生2-3日龄的乳小鼠进行脑内接种，每只小鼠接种0.02ml。逐日观察乳鼠是否发病及发病时间、发病特征、是否死亡。同时设阴性对照，接种Eagle’s培养液0.02ml。每组共8只乳鼠。
接种病毒的两组乳鼠均在4天后出现轻微的临床症状，表现为拒乳、后肢麻痹，两组乳鼠的症状相似并逐渐加重，第6天开始有乳鼠死亡，至第8天接种病毒的两组乳鼠全部死亡。而对照组乳鼠生长状态良好，未见任何临床症状，全部存活。
以上结果表明恢复病毒(BR-XJ160)和亲本病毒XJ160对乳小鼠的致病性没有明显区别。
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序列表<110>中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所<120>辛德毕斯病毒感染性全基因组cDNA克隆<130>
<160>9<170>PatentIn version 3.1<210>1<211>14625<212>DNA<213>人工序列<400>1attgacggcg tagtacacac tattgaatca aacagccgac caatagcact accatcataa60tggagaggcc tgtagttaac gtagacgtag acccccagag tccgtttgtc gctcaactgc120aaaagagctt cccgcaattc gaggtagtag cacagcaggc cacaccaaat gaccatgcta180atgccagagc attttcgcat ctggctagta aattaatcga gctggaggtt cctaccacag240cgacgatttt ggacataggc agcgcaccgg ctcgtagaat gttttccgag caccactatc300actgcgtctg ccctatgcgg agccccgaag atcccgaccg tatgatgaaa tacgccaata360agttggcgga gaaggcaaat aagattacta ataaaaattt gcatgagaag attaaagacc420tccggatcgt actcgatact ccggatgctg agacaccgtc gctctgcttc cataatgacg480ttacctgcag tacgcgtgca gagtactccg ttatgcaaga tgtgtatatt aatgcacccg540gaactattta ccatcaagct atgaaaggcg tgcggacact ttactggatt gggtttgaca600ccactcagtt catgttctcg gctatggcag gatcatatcc tgcctataat actaactggg660ccgatgaaaa agtccttgaa gcacgcaata ttggactctg tagtaccaag ttgagcgaag720gccgtatagg aaagttgtca ataatgagga aaaaggagtt gaagcccggg tcacgggtct780
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<213>人工序列<400>4cgagctcgat ttaggtgaca ctatagattg acggcgtagt acacactatt g 51<210>5<211>24<212>DNA<213>人工序列<400>5cttgcagggg tttgtagtct tcat 24<210>6<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>6cgggatccta agcagtgtgg 20<210>7<211>20<212>DNA<213>人工序列<400>7ctctagatgg ttcgcgggtg 20<210>8<211>23<212>DNA<213>人工序列<400>8catctagagc gttagatatc ctg 23<210>9<211>75
<212>DNA<213>人工序列<400>9ccgctcgagt tttttttttt tttttttttt tttttttttt ttttgaaatg ttaaaaacaa60aattttggtt aattg 7权利要求
1.一种XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于该克隆由低拷贝骨架质粒pBR、病毒基因组全长cDNA片段、基因组5’端的SP6启动子序列和基因组3’端的35个连续的A组成。其中所述的骨架质粒pBR是线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成；所述的病毒基因组全长cDNA片段含有11620个核甘酸，通过所述单酶切位点将覆盖病毒全长基因组的cDNA片段插入到骨架质粒pBR中；所述的SP6启动子序列位于基因组5’端上游紧邻第一个核苷酸A，所述的35个连续的A紧邻基因组3’末端核甘酸C。该感染性全基因组cDNA克隆序列为1 ATTGACGGCG TAGTACACAC TATTGAATCA AACAGCCGAC CAATAGCACT51 ACCATCATAA TGGAGAGGCC TGTAGTTAAC GTAGACGTAG ACCCCCAGAG101 TCCGTTTGTC GCTCAACTGC AAAAGAGCTT CCCGCAATTC GAGGTAGTAG151 CACAGCAGGC CACACCAAAT GACCATGCTA ATGCCAGAGC ATTTTCGCAT201 CTGGCTAGTA AATTAATCGA GCTGGAGGTT CCTACCACAG CGACGATTTT251 GGACATAGGC AGCGCACCGG CTCGTAGAAT GTTTTCCGAG CACCACTATC301 ACTGCGTCTG CCCTATGCGG AGCCCCGAAG ATCCCGACCG TATGATGAAA351 TACGCCAATA AGTTGGCGGA GAAGGCAAAT AAGATTACTA ATAAAAATTT401 GCATGAGAAG ATTAAAGACC TCCGGATCGT ACTCGATACT CCGGATGCTG451 AGACACCGTC GCTCTGCTTC CATAATGACG TTACCTGCAG TACGCGTGCA501 GAGTACTCCG TTATGCAAGA TGTGTATATT AATGCACCCG GAACTATTTA551 CCATCAAGCT ATGAAAGGCG TGCGGACACT TTACTGGATT GGGTTTGACA601 CCACTCAGTT CATGTTCTCG GCTATGGCAG GATCATATCC TGCCTATAAT651 ACTAACTGGG CCGATGAAAA AGTCCTTGAA GCACGCAATA TTGGACTCTG701 TAGTACCAAG TTGAGCGAAG GCCGTATAGG AAAGTTGTCA ATAATGAGGA751 AAAAGGAGTT GAAGCCCGGG TCACGGGTCT ACTTCTCAGT GGGATCAACA801 CTCTACCCAG AATATAGGGA CAGCTTACAG AGCTGGCACC TCCCATCAGT851 GTTCCATCTG AAAGGAAAGC AATCGTATAC ATGCCGCTGT GATACAGTGG901 TAAGTTGCGA AGGCTACGTA GTGAAGAAGA TCACTATTAG TCCCGGGATT951 ACGGGAGAAA CCGTGGGATA CGCGGTTACA AACAATAGCG AGGGTTTCTT1001 GCTATGTAAA GTTACTGACA CAGTAAAAGG GGAACGGGTC TCGTTCCCCG1051 TGTGCACGTA TATCCCGGCC ACCATATGCG ACCAGATGAC AGGTATAATG1101 GCCACGGATA TTTCACCTGA CGATGCACAG AAGCTTCTGG TTGGGCTCAA1151 CCAGAGGATT GTCATTAACG GTAAAACCAA CAGGAACACT AACACCATGC1201 AAAACTACCT TCTACCGATT ATAGCACAAG GCTTCAGCAA GTGGGCTAAA1251 GAGCGCAAAG AAGATCTTGA TAATGAAAAG AAGCTGGGCA CTAGGGAGCG1301 TAAGCTTATT TACGGGTGTC TATGGGCGGT TCGTACTAAG AAAGTGCACT1351 CGTTTTACCG CCCGCCCGGA ACGCAGACCA GCGTGAAAGT CCCGGCATCT1401 TTTAGCGCTT TTCCAATGTC ATCTGTATGG ACAACCTCAC TACCCATGTC1451 GCTGAGGCAG AAGATAAAAT TGGTACTACA ACCGAAAAAG GAGGAGAAAT1501 TACTGCAGGT CTCAGAAGAG TTAGTTGCGG AGGCTAAAGC GGCCTTTGAA1551 GATGCACAGG AGGAGATCAG AGCGGAGCAA CTCCGTGAAG CACTTCCACC1601 ACTGGTAGCA GACAAAGGTA TTGAAGCCGC TGCAGAAGTC GTCTGTGAAG1651 TGGAAGGGCT TCAAGCTGAT ATAGGAGCAG CTCTTGTTGA GACGCCACGA1701 GGGCATGTAA GGATTATACC TCAAGTAACA GACCGCATGA TTGGGCAGTA1751 CATCGTGGTC TCACCAACCT CCGTGCTTAA GAACGCCAAA TTAACACCTG1801 TTCACCCTTT GGCTGACCAA GTCAAAATTA TAACACATTC AGGGAGGACA1851 GGAAGATTCG CGGTGGAGCC GTATGATGCT AAAGTGTTGA TGCCAGCAGG1901 TAGCGCCGTT CCATGGCCTG AGTTCCTGGC GTTAAGTGAA AGCGCCACGC1951 TAGTGTATAA CGAAAGAGAA TTTGTCAACC GCAAACTTTA CCATATCGCC2001 ATACATGGTC CCGCGAAGAA TACTGAAGAG GAGCAGTATA AAGTCACTAA2051 AGCCGAACTC GCAGAAACAG AGTATGTATT TGATGTCGAC AAGAAGCGTT2101 GCGTTAAGAA GGAAGAGGCC TCGGGGCTGG TTCTCTCGGG AGAACTAACT2151 AACCCACCGT ATCATGAAAT GGCGCTTGAG GGGCTGAAGA CTCGACCCGC2201 TGTTCCGTAT AAGGTCGAAA CAATAGGAGT AATAGGCACA CCAGGATCAG2251 GCAAGTCTGC GATTATTAAA TCGACCGTTA CCGTACGAGA TCTTGTTACC2301 AGCGGAAAGA AGGAAAACTG CCGTGAAATT GAAACTGACG TGTTGAGGTT2351 GAGAGGTATG CAGATCACGT CAAGGACGGT AGACTCAGTC ATGCTTAACG2401 GATGCCATAA AGCCGTTGAG GTGCTATACG TTGATGAAGC ATTTGCGTGC2451 CATGCTGGTA CGTTGCTTGC CTTGATCGCT ATTGTTAGAC CCCGAAAGAA2501 GGTAGTACTT CGCGGGGATC CTAAGCAGTG TGGTTTTTTC AATATGATGC2551 AGCTCAAAGT ACATTTTAAT CACCCTGAAA AAGATATATG TACTAAGACG2601 TTTTACAAAT TCATCTCTCG ACGCTGCACG CAACCAGTAA CGGCGATTGT2651 TTCAACACTT CATTACGACG GAAAGATGAA GACTACAAAC CCCTGCAAGA2701 AGAGCATTGA GATAGATATT ACAGGTACTA CGAAGCCGAA GCCCGGGGAC2751 CTCGTTTTGA CGTGCTTCCG CGGATGGGTC AAGCAGCTAC AGATCGATTA2801 CGCGGGAAAT GAAGTGATGA CGGCTGCTGC CTCGCAGGGA CTGACTAGAA2851 AGGGTGTTTA CGCCGTTCGG CAAAAAGTTA ATGAGAATCC ACTGTACGCG2901 ATTACGTCGG AGCACGTGAA CGTGTTACTC ACCCGTACTG AGGATAGATT2951 AGTGTGGAAG ACCTTACAGG GCGATCCATG GATCAAACAA CTTACTAACA3001 TTCCGAAAGG AAACTTCCAA GCTACTATTG AGGACTGGGA AGCTGAACAT3051 AAGGGGATCA TCGCTGCAAT AAACAGCCCA ACCCCTCGTA TAAACCCGTT3101 CAGCTGTAAG ACTAATGTGT GCTGGGCGAA GGCACTGGAA CCGATACTGG3151 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GGTTCAGAGT GGGCATTACT GATACTTTAG CAACTGCTGT AGCAACCCGG7401 TACGAGGTAG ATAATATCAC ACCTGTCTTA TTGGCATTGA GAACGTTTGC7451 CCAGAGCAAA AATTCGTTTC AGGCCATTAG AGGAGAAATA AAGCAACTCT7501 ACGGTGGTCC TAAATAGTCA GCATAGCATA TTTTATCTGA CTAATACTGT7551 AACACCCCTA CTATGAATAG AGGATTCTTT AACATGCTTG GCCGCCGCCC7601 CTTCCCGGCC CCCACTTCTA TGTGGAGGCC ACGTAGAAGG AGGCAGGCGG7651 CCCCGATGCC CGCCCGCAAC GGGTTGGCTT CCCAAATTCA GCAGCTTACC7701 ACAGCAGTTA GCGCCTTGGT TATAGGACAG GCAGCTAGAC CTCAACAGCC7751 ACGTCCTCGC CCGCCACCCC GCCAAAAGAA GCAGCCGCCA AAGCAATTAC7801 CAAAACCGAA GAAACCGAAA ACACAGGATA AGAAGAAGCG ACAGCCCGCG7851 AAGCCGAAAC CTGGAAAGAG GCAGCGCATG GCGCTTAAGC TAGAGGCCGA7901 CAGACTGTTT GATGTTAAGA ACGAGAATGG TGATGTCATC GGACATGCTC7951 TGGCCATGGA AGGAAAAGTA ATGAAACCAC TCCACGTGAA AGGAACTATA8001 GATCACCCAG TGCTGTCGAA GCTTAAATTC ACCAAGTCGT CGGCATATGA8051 CATGGAGTTT GCACAACTTC CTGTCAATAT GCGAAGCGAA GCTTTCACGT8101 ACACCAGCGA GCACCCAGAA GGATTCTATA ACTGGCACCA TGGCGCAGTG8151 CAGTATAGTG GAGGTAGATT CACTATTCCG CGTGGAGTAG 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2.根据权利要求1所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于所述的线性化的质粒pBR322是通过EcoR I和Ava I酶切，除去质粒pBR322中四环素抗性基因Tetr后的剩余部分。
3.根据权利要求1或2所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于所述的连接子由两个互补的寡核苷酸片段SX-和SX+经退火获得，其中SX-和SX+的序列分别为SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’因而生成的所述单酶切位点为Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I。
4.根据权利要求1或2所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆，其特征在于所述的覆盖病毒全长基因组cDNA片段包括三个组装片段NS1、6K和S2，分别依次对应于XJ-160病毒基因组第1-2516位、第2517-8451位、 第8452-11626位核苷酸，同时在NS1片段5’端引入SP6启动子序列，在S2片段3’端引入35个连续的A，第8453位核苷酸由基因组中的C突变为T，由此引入的Xba I位点作为鉴别恢复病毒的遗传标记。
5.一种权利要求1所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，其特征在于它包括(1)从感染XJ-160病毒的乳小鼠脑组织提取RNA；(2)用三对引物通过RT-PCR扩增，得到覆盖病毒全长基因组的三个cDNA组装片段；(3)制备上述三个cDNA组装片段的T载体克隆；(4)经亚克隆操作构建得到XJ-160病毒的全长基因组cDNA克隆；(5)体外转录制备病毒基因组全长RNA；(6)用脂质体转染的方法将上述全长RNA导入哺乳动物细胞；(7)收取含恢复病毒的细胞上清；(8)对恢复病毒进行遗传标记的鉴定；(9)比较恢复病毒与亲本病毒的生物学特性。
6.根据权利要求5所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，其特征在于所述的三对引物及其序列为Sp6f2 5’CGAGCTCGATTTAGGTGACACTATAGATTGATTGACGGCGTAGTACACACTATTG 3’BamR2 5’CTTGCAGGGGTTTGTAGTCTTCAT 3’P5 5’CGGGATCCTAAGCAGTGTGG 3’XbR5’CTCTAGATGGTTCGCGGGTG 3’XbF5’CATCTAGAGCGTTAGATATCCTG 3’X2 5’CCGCTCGAGTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTTGAAATGTTAAAAACAAAATTTTGGTTAATTG 3’由Sp6f2和BamR2扩增得到NS1片段，由P5和XbR扩增得到6K片段，由XbF和X2扩增得到S2片段。
7.根据权利要求5或6所述的XJ-160病毒的感染性全基因组cDNA克隆的构建方法，其特征在于所述的病毒基因组全长cDNA片段的亚克隆操作，包括下述步骤(1)Xba I/Xho I双酶切pGEMT-S2质粒和pBR骨架质粒，得到S2片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-S2；(2)BamH I/Xba I双酶切pGEMT-6K质粒和pBR-S2质粒，得到6kb片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-6K-S2；(3)Sac I/BamH I双酶切pGEMT-NS1质粒和pBR-6K-S2质粒，得到NS1片段和线性质粒，经连接转化获得目的质粒pBR-NS1-6K-S2，该质粒即为XJ-160病毒全基因组cDNA克隆质粒，命名为pBR-XJ160。
8.一种根据权利要求1所述的由线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成的骨架质粒pBR，其特征在于所述的线性化的质粒pBR322是通过EcoR I和AvaI酶切除去质粒pBR322中四环素抗性基因Tetr后的剩余部分；所述的连接子由两个互补的寡核苷酸片段SX-和SX+经退火获得，其中SX-和SX+的序列分别为SX-5’AATTG CTCGAG GTACC TCTAGA CTAGT GAATTC GCATGC GGATCCAAGCTT GAGCTC 3’；SX+3’C GAGCTC CATGG AGATCT GATCA CTTAAG CGTACG CCTAGG TTCGAACTCGAG AGCC 5’因而生成的所述单酶切位点为Sac I，Hind III，BamH I，Sph I，EcoR I，Spe I，Xba I，Kpn I和Xho I。
9.一种根据权利要求8中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途。
10.根据权利要求9中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途，其特征在于所述的RNA病毒为披膜病毒科病毒。
11.根据权利要求9中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途，其特征在于所述的RNA病毒为甲病毒属病毒。
12.根据权利要求9中所述的骨架质粒pBR作为制备RNA病毒全长基因组感染性cDNA克隆载体的用途，其特征在于所述的RNA病毒为辛德毕斯病毒。
全文摘要
本发明提供了一种XJ－160病毒感染性全基因组cDNA克隆pBR－XJ160，该克隆由骨架质粒pBR、含11620个碱基对的病毒基因组全长cDNA、基因组5’端的SP6启动子序列和基因组3’端的35个连续的A组成。其中所述的骨架质粒pBR由线性化的质粒pBR322与含单酶切位点的连接子连接而成；所述的病毒基因组全长cDNA由三个cDNA组装片段通过所述单酶切位点插入骨架质粒pBR组装而成，三个组装片段顺次连接，覆盖了XJ－160病毒的全长基因组；所述的SP6启动子序列位于基因组5’端上游紧邻第一个核苷酸A，所述的35个连续的A紧邻基因组3’末端核甘酸C，该克隆可在宿主菌中稳定传代，其RNA转录体转染宿主细胞后可以产生恢复病毒(BR－XJ160)，并可以通过遗传标记的鉴定区分恢复病毒与亲本病毒。恢复病毒(BR－XJ160)较好的重现了XJ－160病毒的各种生物学特征，该感染性全基因组cDNA克隆是理想的XJ－160病毒的反向遗传学系统。
文档编号C12P19/34GK1621527SQ20031011545
公开日2005年6月1日 申请日期2003年11月25日 优先权日2003年11月25日
发明者梁国栋, 杨益良, 付士红, 何海怀, 侯云德 申请人:中国疾病预防控制中心病毒病预防控制所