专利名称：O型口蹄疫病毒dna疫苗及其制备方法
技术领域：
本发明主要涉及O型口蹄疫病毒DNA疫苗及其研制方法，具体地，涉及利用基因重组技术，构建两种包含O型口蹄疫病毒结构蛋白基因和一部分非结构蛋白基因的DNA疫苗的研制方法及其产品、用途。
背景技术：
DNA疫苗能够诱导保护性细胞免疫及体液免疫反应，在最近几年里用于研制抵抗多种不同病原的疫苗。由于目前所用的抗病毒疫苗主要诱导体液免疫，因此DNA免疫可能对于提供长效的抗病毒性疾病的保护是非常有用的。大量发表的DNA疫苗领域的文章主要与病毒性疾病有关，这反映了在抗病毒方面对于新型、安全、有效的免疫策略的强烈需要。口蹄疫病毒(Foot-and-Mouth disease virus，FMDV)是一种引起偶蹄动物严重疾病的病毒，由于其常造成严重的经济损失，因而被国际兽疫局(OIE)列为A类传染病。目前，对口蹄疫的防治主要应用来自活病毒的传统疫苗的接种免疫，尽管这种传统疫苗是有效的，但近年来，尤其在欧洲爆发的几次口蹄疫可能与病毒的未完全灭活和从疫苗生产地逃逸有关。因此必须研制开发一种更为安全、有效的口蹄疫疫苗。
资料表明，缺乏核酸而包含VP1、VP3和VPO的自然空衣壳能够在豚鼠体内诱导与完整病毒粒子相似的抗体反应(Rowlands et al，1975)，而且结构蛋白前体P1-2A首先在2A介导作用下由3C蛋白酶裂解为VPO，VP3和VP1，其中VPO继续裂解为VP2，VP4。这四种结构蛋白以各60个拷贝的形式构成病毒粒子20面体衣壳结构，在这些结构蛋白上均有抗原决定簇，尤其以VP1上的抗原表位最为重要。非结构蛋白2B、3D也是细胞免疫和体液免疫的潜在刺激因子。(Foster-cuevas，1996，Foster etal，1998，Collen et al，1998)。
发明内容
本发明提供编码DNA序列，其(优选顺序地)包含口蹄疫病毒(优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒)结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因，优选其具有SEQ ID NO1或2的序列。
本发明还提供转录单位，其含有本发明的编码DNA序列和与该DNA序列可操作地连接的、在真核细胞(特别是哺乳动物细胞)中表达该DNA序列所必需的表达调控元件(尤其是启动子，如病毒启动子或哺乳动物细胞启动子，和转录终止序列)，优选地，其是序列质粒pcDNA3.1/P12X3C或pcDNA3.1/P12X3C3D所包含的转录单位。
本发明进一步提供用作FMDV DNA疫苗的真核表达载体，其含有本发明的转录单位。
在一个优选实施方式中，本发明的表达载体是质粒，例如含有本发明的转录单位的真核表达质粒，优选地，其是质粒pcDNA3.1/P12X3C或pcDNA3.1/P12X3C3D。
本发明还提供构建本发明表达载体的方法，该方法包括获得编码口蹄疫病毒(优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒)结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的DNA序列，采用已知技术将编码口蹄疫病毒结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的DNA序列分段克隆到空的真核表达载体(特别是质粒)中，形成能够表达结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的重组表达载体。
本发明还提供DNA疫苗，其包含一种或多种本发明的表达载体和一种或多种可药用载体，例如稀释剂。
本发明也涉及制备DNA疫苗的方法，所述方法包括采用已知技术构建一种或多种本发明的表达载体，将得到的表达载体与一种或多种可药用载体混合。
本发明还涉及口蹄疫病毒结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因在制备DNA疫苗中的用途。
还涉及本发明的转录单位，本发明的表达载体在制备DNA疫苗中的用途。
本发明的再一方面是预防和/或治疗非人动物口蹄疫的方法，包括给所述动物施用有效量的本发明的疫苗。
本发明还提供含有本发明表达载体的宿主细胞，例如原核细胞，如大肠杆菌细胞，和真核细胞，如哺乳动物细胞。
在参考下列详述和附图后，本发明的这些和其它方面将是显然的。此处公开的所有参考文献在此均完整引用作为参考。
图1是本发明得到的3’突变的片段I、5’突变的片段II以及全长P12X3C的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图2是琼脂糖凝胶电泳图谱，显示阳性质粒pcDNA3.1/P12X3C的鉴定结果。
图3是本发明得到的3D片段、P12X3C片段以及P12X3C3D片段的琼脂糖凝胶电泳图谱。
图4是琼脂糖凝胶电泳图谱，显示阳性质粒pcDNA3.1/P12X3C3D的鉴定结果。
图5是转染的BHK-21细胞间接免疫荧光染色照片。
图6是ELISA折线图，显示不同稀释度下样品的OD492值。
图7是体内免疫后抗体水平动态变化折线图。
图8显示免疫豚鼠T淋巴细胞增殖反应。
图9示意获得目的片断III的过程。
图10示意质粒pcDNA3.1/P12X3C的构建过程。
图11示意质粒pcDNA3.1/P12X3C3D的构建过程。
具体实施例方式
除非特别指明，本文所采用的术语具有本发明所属技术领域通常的含义。
本发明使用的病毒可以是任何口蹄疫病毒(属于口疮病毒属(Aphtovirus))，优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒。口蹄疫病毒基因组编码序列按功能可以分为三个部分5’-P1-P2-P3-3’，再经蛋白酶水解成各种最终产物。例如P2的最终产物是2A、2B和2C，P3的最终产物可以是3A、3B、3C和3D。本发明的一个特点在于将P1基因、2A、2B、3C以及可有可无的3D基因用于构建口蹄疫病毒DNA疫苗。
因此，首先，本发明提供包含FMDV P1、2A、2B、3C以及可有可无的3D基因的编码DNA序列。优选地，该DNA序列依次顺序地包含口蹄疫病毒(优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒)结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因，或依次顺序地由它们组成。
在编码DNA序列中，FMDV P1、2A、2B、3C以及3D基因优选是天然的或野生型的病毒的相应序列，也可以是修饰的序列。所述修饰优选是性质较小的改变(包括替代、缺少、插入、添加)，即保守氨基酸替代和其它不显著影响蛋白质或多肽的折叠或活性的替代；小的缺失，典型的是1至大约30个氨基酸的缺失；和小的氨基或羧基端延伸，例如氨基端的甲硫氨酸残基、不超过大约20-25个残基的小接头肽或亲和标记物。在一个优选实施方式中，所述修饰不改变或基本不改变所编码的氨基酸序列。
在一个具体的实施方式中，上述编码DNA序列具有SEQ ID NO1或2的序列。
编码FMDV基因组目的片段的DNA序列可以采用已知的分子生物学技术从FMDV获得。例如可以通过逆转录从病毒RNA得到第一链cDNA，然后利用适当的引物从该第一链通过聚合酶链式反应合成期望的双链DNA，然后任选地经过拼接克隆到一个或多个载体中。
本发明还提供用于表达上述编码DNA序列的转录单位。该转录单位除了含有上述编码DNA序列外，还含有与该DNA序列可操作连接的、在真核细胞中表达(转录和翻译)该DNA序列所必需的表达调控元件。最基本的表达调控元件包括启动子和转录终止子，后者能有效地终止转录和给转录产物有效地加上Poly(A)尾。其它的调控元件可以有增强子等。这些调控元件是本领域所熟知的，参见例如Sambrook等，分子克隆实验室手册(Molecular CloningA Laboratory Manual)，第二版，ColdSpring Harbor，NY，1989。
通常，该转录单位存在于表达载体中。表达载体是线性或环状DNA分子，其含有编码目的多肽的片段和为了表达该目的片段而与之可操作连接的其它片段。这些其它片段可以包括启动子与终止子序列、和任选的一或多个复制原点、一或多个选择标记、增强子、聚腺苷酸化信号等等。表达载体一般来源于质粒或病毒DNA，或可以同时含有两者的元件。
这些元件的强度和特异性可能不同。根据所用的载体系统和宿主，可以使用任何数量的适当转录和翻译元件，包括组成型和诱导型启动子，优选组成型启动子。在哺乳动物细胞系统中，通常优选来自哺乳动物基因或哺乳动物病毒的启动子。
也可用特异起始信号实现编码目的多肽的序列的更有效翻译。这些信号包括ATG起始密码子和相邻序列。在编码多肽的序列、其起始密码子和上游序列插入适当表达载体中时，可不需要其它转录或翻译控制信号。然而，在只插入编码序列或其部分时，应当使用外源翻译控制信号，包括ATG起始密码子。此外，起始密码子应当在正确的阅读框内，以确保整个插入片段的翻译。外源翻译元件和起始密码子可以是不同来源的，是自然的和合成的。
用于表达本发明编码DNA序列的表达载体可以是任何能够方便地用于重组DNA程序并能使DNA序列表达的载体(如质粒或病毒)。典型地，载体的选择取决于载体和载体将要导入的宿主细胞之间的相容性。该载体也可以是病毒载体，例如，腺病毒、腺相关病毒、逆转录病毒、或痘苗病毒或其它痘病毒(例如禽类痘病毒)。该载体优选是线性或闭合环状质粒。
该载体可以是自主复制型载体，即作为染色体外实体而存在、其复制独立于染色体复制的载体，如质粒、染色体外因子、微型染色体或人工染色体。该载体可以含有任何保证自我复制的序列。或者，该载体可以是当导入宿主细胞后整合在基因组中并和它所整合的染色体一起复制的载体。而且，可使用单个载体或质粒，或一起含有待导入宿主细胞基因组中的全部DNA的两个或多个载体或质粒。
本发明载体可以含有一个或多个允许方便地选择转化细胞的选择标记。选择标记是其产物提供杀生物剂或病毒抗性、重金属抗性、相对营养缺陷型的原养型等的基因。细菌选择标记的例子是枯草芽孢杆菌或地衣芽孢杆菌的dal基因，或赋予抗生素抗性如氨苄青霉素、卡那霉素、氯霉素或四环素抗性的标记。用于酵母宿主细胞的适当标记是ADE2、HIS3、LEU2、LYS2、MET3、TRP1和URA3。本发明的载体可以包含允许该载体稳定整合至宿主细胞基因组中或允许该载体在该细胞中独立于基因组而自主复制的一个或多个元件。
为了整合至宿主细胞基因组中，该载体可以依赖于编码所述多肽的核酸序列或用于使该载体通过同源或非同源重组稳定整合至基因组中的任何其它载体元件。或者，该载体可以含有用于通过同源重组指导向宿主细胞基因组中整合的额外核酸序列。
为了自主复制，该载体可以进一步包含使载体能在细菌细胞中自主复制的复制起点。细菌复制起点的例子是允许在大肠杆菌中复制的pBR322、pUC19、pACYC177和pACYC184质粒的复制起点和允许在芽孢杆菌属中复制的pUB110、pE194、pTA1060和pAMβ1质粒的复制起点。
可在宿主细胞中插入一个以上拷贝的本发明核酸序列，以增加基因产物的产量。该核酸序列拷贝数的增加可以通过如下方法实现在宿主细胞基因组中至少再整合一个额外拷贝的该序列；或在细胞中包括带有该核酸序列的可扩增选择标记基因，在适当选择剂存在时培养这些细胞，能够选出含有扩增拷贝的选择标记基因、因此也含有额外拷贝的该核酸序列的细胞。
用于连接上述元件以构建本发明的重组表达载体的程序是本领域技术人员熟知的(见例如，Sambrook等，分子克隆实验室手册(MolecularCloningA Laboratory Manual)，第二版，Cold Spring Harbor，NY，1989；和Ausubel等编，当代分子生物学实验指南(Current Protocolsin Molecular Biology)，John Wiley and Sons，Inc.，NY，1987)。
本发明还提供本发明载体转化或转染的宿主细胞。宿主细胞可以是原核细胞，如大肠杆菌细胞，或真核细胞，如哺乳动物细胞。将外源DNA导入各种宿主细胞中的技术公开于例如Sambrook等，同上，和Ausubel等，同上。
含有并表达希望的多核苷酸序列的宿主细胞可用本领域技术人员周知的多种方法鉴定。这些方法包括但不限于DNA-DNA或DNA-RNA杂交和蛋白质生物测定或免疫测定技术，包括如基于膜、溶液或芯片的技术，PCR等等。
本发明的重组宿主细胞可以用作产生本发明DNA序列、转录单位、表达载体的来源。
本发明还提供包含本发明表达载体的DNA疫苗，用于在动物(特别是哺乳动物)中预防和/或治疗口蹄疫。本发明的DNA疫苗可以除了含有本发明表达载体外，还可以含有可药用载体，例如稀释剂、佐剂等，这些可药用载体可以是普通DNA疫苗中所采用的任何辅助物质。
关于制剂、给药途径、方式和剂量，本发明的DNA疫苗可以和普通疫苗，尤其是普通DNA疫苗所采用的类似。而且，可以由本领域技术人员容易地确定。
在DNA疫苗中，本发明质粒的剂量可以是0.01-0.1mg/kg，优选0.02-0.05mg/kg。
在具体实施方案中，本发明提供携带FMDV结构蛋白P1基因及部分非结构蛋白2A、2B、3C基因或携带FMDV结构蛋白P1基因及部分非结构蛋白2A、2B、3C、3D基因的两种质粒DNA，并以其分别制造有效防治家畜口蹄疫的、安全稳定的DNA疫苗，同时提供其研制方法。
为实现以上目的，本发明提供了如下方案从携带不同片段的T载体上获得不同目的基因片段，通过定点突变技术得到全长P12X3C基因，再通过酶切连接构建带有P12X3C基因的质粒。并从构建好的带有P12X3C基因的质粒载体和带有3D基因的T载体上分别获得基因片段P12X3C和3D，通过酶切连接构建带有P12X3C3D基因的质粒DNA。
本发明包括两种O型FMDV DNA疫苗，分别包括编码FMDV China99株结构蛋白P1、非结构蛋白2A、2B、3C的基因及编码FMDV China99株结构蛋白P1、非结构蛋白2A、2B、3C、3D的基因，将其构建的质粒DNA经纯化、稀释，直接作为DNA疫苗接种家畜即可刺激动物机体产生免疫反应并提供免疫保护。
本发明的家畜FMDV DNA疫苗的制造方法，包括基因重组、细胞转染、蛋白检测、DNA疫苗的制备，其具体的制造过程为(1)以连接有China99株FMDV相应基因片段的T载体模板，扩增出部分带有P1-2A基因的片段I和带有另一部分2B、3C基因的片段II，根据定点突变原理通过PCR扩增方法将其连接成带有全长P1-2A2B3C基因的片段III，并在其上下游引入KpnI、和XbaI位点，通过酶切将其与经同样酶处理的质粒载体相连，从而构建带有P1-2A、2B、3C基因的质粒DNApcDNA3.1/P12X3C。
(2)分别以质粒pcDNA3.1/P12X3C和带有3D基因片段的T载体为模板，扩增出全长P1-2A2B3C和3D基因，分别在其上下游引入AflII、KpnI和KpnI、XbaI位点，通过酶切连接方法，将其与经同样酶切处理的pcDNA3.1(+)连接，从而构建带有P1-2A、2B、3C、3D基因的质粒pcDNA3.1/P12X3C3D。
(3)将构建的质粒DNA纯化后，转染BHK-21细胞，采用间接荧光染色法及夹心ELISA方法，检测目的基因在载体上的CMV启动子控制下于体外环境表达的目的蛋白。
(4)将构建的两种质粒DNA分别用碱裂解法大量提取并纯化，用缓冲液DPBS稀释成一定浓度后，以其作为DNA疫苗直接注射动物。
在本发明的具体实施过程中，DNA疫苗的制造包括用特异引物获得目的基因、重组质粒的构建、重组质粒在体外的转染、制备DNA疫苗及将其免疫动物。将真核表达质粒pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司，Cat NoV860-20)作为构建DNA疫苗的载体。利用设计的特异引物从带有不同目的基因的T载体上扩增出目的片段I、II，并根据定点突变的原理应用一对表达引物将片段I和II用PCR扩增方法得到片段III，在片段III的5′端和3′端分别引入KpnI和XbaI位点。用内切酶KpnI和XbaI同时将片段III酶切后，与用同样两种酶处理的pcDNA3.1(+)连接从而构建第一种质粒pcDNA3.1/P12X3C。其中，片段I的上下游引物分别为上游引物5′-ACCTCCRACGGGTGGTACGC-3′下游引物5′-CACTGCCACTTCAAGTTCTGCGAAG-3′片段II的上下游引物分别为上游引物5′-CTTCGCAGAACTTGAAGTGGCAGTG-3′下游引物5′-CAGCTATGACCATGATTACGCCAAG-3′扩增片段III的表达引物分别为上游引物5′-GG ATGGGAGCCGGACAATCCAGCCCGGCGAC-3′下游引物5′-GC CCTCGTGGTGTGGTTCGGGATCGATGTGTG-3′再分别以带有3D基因片段的T载体和构建的第一种载体pcDNA3.1/P12X3C为模板，应用特异的两对引物通过PCR扩增得到3D基因片段和P12X3C基因片段，并分别在3D基因片段的5′端和3′端引入KpnI和XbaI位点，在P12X3C基因片段的5′端和3′端引入AflII和KpnI位点。用内切酶KpnI和XbaI酶切处理3D基因片段，用内切酶AflII和KpnI酶切处理P12X3C基因片段，先后分别将酶切处理的3D基因片段和P12X3C基因片段与先后用内切酶KpnI、XbaI、AflII处理的pcDNA3.1(+)，从而构建第二种质粒pcDNA3.1/P12X3C3D。其中，3D基因的扩增引物分别为上游引物C(+)5′-GG CACTCCGCAGGCGGCAACGGAGTTGG-3′下游引物Dg(-)5′-GG ATGCGTCACCGCACACGGCGTTACAA-3′P12X3C基因扩增的引物分别为上游引物A(+)5′-GG ATGGGAGCCGGACAATCCAGCCCGGCGAC-3下游引物B(-)5′-GG AACGATTGAAAGTCTCGGCTCCGTCC-3′将两种重组质粒分别采用脂质体转染方法，在35mm平皿上转染BHK-21细胞，转染24-48小时之后，收获细胞单层并用细胞裂解液(100mMTris-HCl，pH 8.3-8.6，2％Triton X-100,150nm NaCl，0.6M KCl，5mMEDTA，1％ aprotinin，3mMPMSF，1μg/ml leupeptin，5μg/ml trypsininhibitor)以一定比例处理。将此裂解液用PBST倍比稀释，于96孔酶标板上采用双抗体夹心ELISA方法测定FMDV衣壳蛋白的表达。并将长满转染后的BHK-21细胞的盖玻片，以间接荧光染色法检测BHK-21细胞中FMDV特异蛋白的表达。两种方法均检测到在真核表达载体上CMV启动子的作用下，FMDV衣壳蛋白基因能在体外培养细胞系统中表达，并证明了这些蛋白具有免疫原性。
将两种质粒DNA用碱裂解法大量提取，并用膜吸附洗脱法纯化，用DPBS缓冲液稀释成浓度为1μg/μl，将其作为DNA疫苗直接注射豚鼠后腿部肌肉内，在第一次免疫后的第1周、2周、3周、4周及第二次免疫后的第1周、2周、3周分别采血，测其血清中的FMDV特异抗体，并在免疫前、第一次免疫的第28天、第二次免疫的第21天，应用微量中和实验检测血清血清中和抗体滴度，并应用T淋巴细胞增殖实验检测动物脾脏T淋巴细胞在植物血凝素(PHA)刺激下的增殖情况。结果显示，两种质粒免疫组的豚鼠体内，产生FMDV特异抗体和中和抗体，质粒免疫豚鼠的脾脏淋巴细胞出现较强的增殖反应，而对照组豚鼠血清及T淋巴细胞没有类似变化。在第二次免疫后的第三周攻以100ID50的FMDV China99毒株，免疫豚鼠的保护率为100％，而对照组豚鼠全部死亡。
本发明中构建的两种质粒作为FMDV DNA疫苗具有以下显著的特点能够在动物体内表达FMDV衣壳蛋白，从而刺激特异的抗体及中和抗体；能够模拟FMDV自然感染细胞的过程，在细胞内经历转录、表达、递呈等将FMDV衣壳蛋白作为内源性抗原蛋白，刺激机体T淋巴细胞增殖分化，从而诱导较强的细胞免疫反应。因此本发明中的两种DNA疫苗能够显著提高免疫家畜的免疫能力，可使家畜抵抗FMDV的感染。
以下通过非限制性的实施例对本发明进行更详细的描述实施例实施例1第一种质粒pcDNA3.1/P12X3C的构建为了在获得全长P12X3C基因时，在下游引物中引入XbaI位点作为克隆用的酶切位点，同时利用XbaI位点中的终止密码子，必须将P1基因片段上的一个已有的XbaI酶切位点突变掉。因此，利用上游引物A5′-ACCTCCRACGGGTGGTACGC-3′和下游引物A15′-CACTGCCACTTCAAGTTCTGCGAAG-3′，其中在下游引物中通过碱基替换引入了改变的(失效的)XbaI位点，以带有P1-2A基因片段的T载体pT/P1-2A[本实验室构建，为P1-2A基因连接到pGEM-T Easy VectorSystem(购自Promega公司，Cat NoA3610)中的产物]为模板，PCR扩增获得3′XbaI位点被突变的部分P1基因(片段I)。扩增片段I的反应体系(50μl)为10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl23μl，pT/P1-2A0.5μl，上游引物A 0.5μl，下游引物A1 0.5μl，Taq DNA聚合酶(5U/μl；购自Promega公司，Cat NoM1661)0.5μl，H2O 36μl。反应条件为94℃ 3min，一个循环；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 1min 30sec，循环35次；最后是72℃ 5min。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色。结果见图1泳道1。由图可见，得到了预期大小的片段。
另外，利用上游引物B5′-CTTCGCAGAACTTGAAGTGGCAGTG-3′和下游引物B15′-CAGCTATGACCATGATTACGCCAAG-3′，其中上游引物B中通过碱基替换引入改变的(失效的)XbaI位点，以带有部分P1基因、2B基因和全长3C基因的T载体pT/P12X3C[本实验室构建，为P12X3C基因连接到pGEM-T Easy Vector System(购自Promega公司，Cat NoA3610)中的产物]为模板，PCR扩增获得5′XbaI位点被突变的部分P1-2A、2B和全长3C基因(片段II)。扩增片段II的反应体系(50μl)为10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl23μl，pT/P12X3C 0.5μl，上游引物B 0.5μl，下游引物B1 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，H2O 36μl。反应条件为94℃ 5min，一个循环；94℃ 1min，55℃ 1min，72℃ 3min，循环35次；最后是72℃ 8min。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色。结果见图1泳道2。由图可见，得到了预期大小的片段。
将片段I(未纯化)和片段II(未纯化)作为模板，用上游引物C5′-GG ATGGGAGCCGGACAATCCAGCCCGGCGAC-3′和下游引物C15′-GC CCTCGTGGTGTGGTTCGGGATCGATGTGTG-3′，通过PCR扩增获得全长的基因片段P12A2B3C(片段III)。其中上游引物中引入KpnI酶切位点，下游引物中引入XbaI位点。扩增片段III的反应体系(50μl)为10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl23μl，片段I(未纯化)0.5μl，片段II(未纯化)0.5μl，上游引物C 0.5μl，下游引物C1 0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，H2O 35.5μl。反应条件为94℃ 5min，一个循环；94℃ 1min20sec，60℃ 1min，72℃ 3min30sec，循环35次；最后是72℃ 10min。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色。结果见图1泳道3。由图可见，得到了预期大小的片段。图9示意了获得目的片断III的过程。
将片段III剩余PCR产物电泳分离纯化(按照Takara公司AgaroseGel DNA Purification Kit Ver 2.0，Cat NoDV805A操作说明进行，浓度为0.5μg/μl)用内切酶KpnI(购自Takara公司，Cat NoD1068A)和XbaI(购自Takara公司，Cat NoD1093A)同时将片段III酶切并纯化，然后用T4 DNA连接酶(购自Takara公司，Cat NoD2011A)按照供应商的说明将酶切纯化后的片段III与用同样两种酶处理的pcDNA3.1(+)(购自Invitrogen公司，Cat NoV860-20)连接。将连接产物按照氯化钙方法转化大肠杆菌JM109菌株。挑取可能的阳性菌落，扩增培养，用碱裂解法小量提取质粒。分别用PCR扩增法(采用引物C和C1)和限制酶完全消化法(分别采用单独的EcoRI和联合的XbaI/KpnI酶切)鉴定阳性质粒。图2是一个阳性质粒的鉴定结果(1％琼脂糖凝胶电泳)，其中，泳道5是PCR鉴定结果，表明得到了预期大小的产物；泳道3是EcoRI完全酶切结果，泳道4是XbaI/KpnI完全酶切结果，结果符合预期的酶切图谱。将此阳性质粒称为第一种质粒pcDNA3.1/P12X3C(构建过程及质粒图谱参见图10)。
将质粒pcDNA3.1/P12X3C测序(由Takara公司测序)，得到所克隆的片段的完整序列，见SEQ ID NO1，如下。
GGTACCATGGGAGCCGGACAATCCAGCCCGGCGACTGGGTCACAGAACCAGTCAGGCAACACTGGAAGCATTATCAACAA
TTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAACTTGGTGATAACGCTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCCACCCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCTGGCCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTCGCCGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCACTACCCGCAACGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTGGAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGACCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAGGGTTGTGCAGGCAGAGCGGTTCTTCAAAACCCACTTGTTCGACTGGGTCACCGGTGACCCGTTCGGACGGTGCTACCTGCTGGAACTCCCAACTGACCACAAAGGTGTCTACGGCGGCCTGACTGACTCTTATGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCAGTGGGAAATCAGTTCAACGGAGGATGTCTGTTGGTGGCCATGGTGCCAGAACTTTGCTCTATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTCACGCTCTTTCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACGGCGCACATCACTGTGCCCTTTGTTGGTGTCAACCGCTACGACCAGTACAAGGTACACAAACCTTGGACCCTCGTGGTTATGGTTGTGGCCCCGCTGACTGTCAACACCGAAGGTGCCCCACAGATCAAGGTCTATGCCAACATCGCCCCTACCAACGTGCACGTTGCGGGTGAGTTCCCTTCTAAGGAAGGGATCTTCCCCGTGGCATGTAGCGACGGTTACGGTGGTCTGGTGACCACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGCCTACGGGAAAGTGTTCAATCCACCTCGCAACATGTTGCCGGGGCGGTTCACCAACTTCCTTGATGTGGCTGAGGCGTGCCCTACGTTTCTGCACTTTGAGGGTGACGTGCCGTACGTGACCACAAAGACGGACTCAGACAGGGTGCTCGCCCAGTTTGACTTGTCTCTGGCAGCAAAGCACATGTCAAACACCTTCCTGGCAGGTCTCGCCCAGTACTACACACAGTACAGCGGCACCATCAACCTGCACTTCATGTTCACAGGACCCACTGACGCGAAAGCGCGTTACATGATTGCATACGCCCCCCCTGGCATGGAGCCGCCCAAAACACCTGAGGCGGCCGCTCACTGCATTCATGCGGAGTGGGACACAGGGTTGAATTCAAAATTCACATTTTCAATCCCTTACCTTTCGGCGGCTGATTACGCGTACACCGCGTCTGACGCTGCGGAGACCACAAATGTACAGGGATGGGTCTGCCTGTTTCAAATTACACACGGGAAGGCTGACGGCGACGCACTGGTCGTTCTAGCTAGCGCCGGTAAGGACTTTGAGCTGCGTCTGCCAGTTGACGCTCGCACGCAGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCCGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGATCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCATGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGACGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTGTTGGCCCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGTGCCGTCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCGAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATCGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTGAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTCTGACGTCAGGTCAAATCTTTCCAAGTTGGTTGAAACCATCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCGGATCCAGGACCGGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCAAAGAATTTGATTGTC
ACTGAGAGTGGTGCTCCCCCGACTGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAGCTCATCCTCGACGGGAAGACGGTGGCCATCTGCTGCGCCACCGGAGTGTTTGGTACTGCCTACCTTGTTCCTCGTCATCTTTTCGCAGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGACGGCAGAGCCATGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTGAAAGGACAGGACATGCTCTCAGACGCCGCGCTCATGGTGCTTCACCGTGGGAATCGCGTGCGGGACATCACGAAGCACTTCCGTGATGTGGCAAGAATGAAGAAAGGCACCCCCGTCGTCGGCGTGATCAACAACGCTGATGTTGGGAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCCCTTACCTACAAGGACATCGTAGTGTGCATGGACGGAGACACCATGCCCGGTCTCTTCGCCTACAAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGAGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATCGTCGGCACTCACTCCGCAGGCGGCAATGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCACACATCGATCCCGAACCACACCACGAGGTCTAGA实施例2第二种质粒pcDNA3.1/P12X3C3D的构建以带有3D基因片段的T载体[pGEM/3D，为3D基因与pGEM-T EasyVector System(购自Promega公司，Cat NoA3610)连接的产物]为模板，应用上游引物C(+)5′-GG CACTCCGCAGGCGGCAACGGAGTTGG-3′和下游引物Dg(-)5′-GG ATGCGTCACCGCACACGGCGTTACAA-3′通过PCR扩增得到3D基因片段，分别在3D基因片段的5′端和3′端引入KpnI和XbaI位点。扩增片段3D基因的反应体系(50μl)为10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl23μl，引物C(+)0.5μl，引物Dg(-)0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，H2O 36.5μl。反应条件为94℃ 5min，一个循环；94℃ 1min，56℃ 1min，72℃ 1min30sec，循环35次；最后是72℃ 10min。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色。结果见图3泳道1。由图可见，得到了预期大小的片段，将剩余3D扩增片段纯化(按照Takara公司Agarose Gel DNA Purification Kit Ver2.0，Cat NoDV805A操作说明进行，浓度为0.5μg/μl)后用内切酶KpnI(购自Takara公司，Cat NoD1068A)和XbaI酶(购自Takara公司，CatNoD1093A)切处理3D基因片段，并再次纯化用以构建pcDNA3.1/P12X3C3D。
以构建的第一种载体pcDNA3.1/P12X3C为模板，用上游引物A(+)5′-GG ATGGGAGCCGGACAATCCAGCCCGGCGAC-3′和下游引物B(-)5′-GG AACGATTGAAAGTCTCGGCTCCGTCC-3′通过PCR扩增得到P12X3C基因片段，分别在P12X3C基因片段的5′端和3′端引入AflII和KpnI位点。扩增片段P12X3C基因的反应体系(50μl)为10×缓冲液5μl，dNTPs 4μl，MgCl23μl，引物A(+)0.5μl，引物B(-)0.5μl，Taq DNA聚合酶0.5μl，H2O 36.5μl。反应条件为94℃ 5min，一个循环；94℃ 1min30sec，60℃ 1min20sec，72℃ 4min30sec，循环35次；最后是72℃ 10min。取少量PCR产物在1％琼脂糖凝胶上电泳分离，EB染色。结果见图3泳道2。由图可见，得到了预期大小的片段。将所得P12X3C片段纯化(按照Takara公司Agarose Gel DNAPurification Kit Ver 2.0，Cat NoDV805A操作说明进行，浓度为0.5μg/μl)后用内切酶Afl II(购自Takara公司，Cat NoD1003A)和Kpn I(购自Takara公司，Cat NoD1068A)酶切并纯化，将处理的P12X3C基因片段与用内切酶Kpn I、Afl II处理的pcDNA3.1(+)连接，得到一中间质粒。然后将得到的中间质粒用KpnI、XbaI酶切，之后与预先以同样双酶切的3D片段连接，从而构建第二种质粒pcDNA3.1/P12X3C3D(构建过程及质粒图谱参见图11)。将连接产物按照氯化钙方法转化大肠杆菌JM109菌株。挑取可能的阳性菌落，扩增培养，用碱裂解法小量提取质粒。分别用PCR扩增法(采用引物A(+)和Dg(-))和限制酶完全消化法(分别采用AflII/KpnI和KpnI/XbaI酶切)鉴定阳性质粒。图4是一个阳性质粒的鉴定结果(1％琼脂糖凝胶电泳)，其中，泳道3，4，5是PCR鉴定结果，表明得到了预期大小的产物；泳道6，7是完全酶切结果，结果符合预期的酶切图谱。
将质粒pcDNA3.1/P12X3C3D测序(由Takara公司测序)，得到所克隆的片段的完整序列，见SEQ ID NO2，如下。
CTTAAGATGGGAGCCGGACAATCCAGCCCGGCGACTGGGTCACAGAACCAGTCAGGCAACACTGGAAGCATTATCAACAATTACTACATGCAGCAGTACCAGAACTCCATGGACACGCAACTTGGTGATAACGCTATTAGCGGAGGCTCCAACGAGGGGTCCACGGACACCACCTCCACCCACACAACCAACACTCAGAACAATGACTGGTTTTCAAAGCTGGCCAGTTCCGCTTTTAGCGGTCTTTTCGGCGCTCTTCTCGCCGACAAGAAAACCGAGGAGACCACTCTTCTCGAGGACCGCATCCTCACTACCCGCAA
CGGACACACGACCTCGACAACCCAGTCGAGCGTTGGAGTCACTTACGGGTACGCAACAGCTGAGGACTTTGTGAGCGGACCAAACACATCTGGGCTTGAGACCAGGGTTGTGCAGGCAGAGCGGTTCTTCAAAACCCACTTGTTCGACTGGGTCACCGGTGACCCGTTCGGACGGTGCTACCTGCTGGAACTCCCAACTGACCACAAAGGTGTCTACGGCGGCCTGACTGACTCTTATGCTTACATGAGAAACGGTTGGGATGTTGAGGTCACTGCAGTGGGAAATCAGTTCAACGGAGGATGTCTGTTGGTGGCCATGGTGCCAGAACTTTGCTCTATTGACAAGAGAGAGCTGTACCAGCTCACGCTCTTTCCCCACCAGTTCATCAACCCCCGGACGAACATGACGGCGCACATCACTGTGCCCTTTGTTGGTGTCAACCGCTACGACCAGTACAAGGTACACAAACCTTGGACCCTCGTGGTTATGGTTGTGGCCCCGCTGACTGTCAACACCGAAGGTGCCCCACAGATCAAGGTCTATGCCAACATCGCCCCTACCAACGTGCACGTTGCGGGTGAGTTCCCTTCTAAGGAAGGGATCTTCCCCGTGGCATGTAGCGACGGTTACGGTGGTCTGGTGACCACTGACCCAAAGACGGCTGACCCCGCCTACGGGAAAGTGTTCAATCCACCTCGCAACATGTTGCCGGGGCGGTTCACCAACTTCCTTGATGTGGCTGAGGCGTGCCCTACGTTTCTGCACTTTGAGGGTGACGTGCCGTACGTGACCACAAAGACGGACTCAGACAGGGTGCTCGCCCAGTTTGACTTGTCTCTGGCAGCAAAGCACATGTCAAACACCTTCCTGGCAGGTCTCGCCCAGTACTACACACAGTACAGCGGCACCATCAACCTGCACTTCATGTTCACAGGACCCACTGACGCGAAAGCGCGTTACATGATTGCATACGCCCCCCCTGGCATGGAGCCGCCCAAAACACCTGAGGCGGCCGCTCACTGCATTCATGCGGAGTGGGACACAGGGTTGAATTCAAAATTCACATTTTCAATCCCTTACCTTTCGGCGGCTGATTACGCGTACACCGCGTCTGACGCTGCGGAGACCACAAATGTACAGGGATGGGTCTGCCTGTTTCAAATTACACACGGGAAGGCTGACGGCGACGCACTGGTCGTTCTAGCTAGCGCCGGTAAGGACTTTGAGCTGCGTCTGCCAGTTGACGCTCGCACGCAGACCACCTCCACAGGTGAGTCGGCTGACCCCGTGACTGCCACTGTTGAGAACTACGGTGGTGAGACACAGGTCCAGAGACGCCAACACACGGATGTCTCGTTCATATTAGACAGATTTGTGAAAGTAACACCAAAAGACCAAATTAATGTGTTGGACCTGATGCAAACCCCTGCACACACTTTGGTAGGCGCGCTCCTCCGTACTGCCACCTACTACTTCGCAGATCTAGAAGTGGCAGTGAAACACGAGGGGAACCTTACCTGGGTCCCGAATGGGGCGCCCGAGACAGCGTTGGACAACACCACCAATCCAACGGCTTACCACAAGGCACCGCTCACCCGGCTTGCACTGCCTTACACGGCACCACACCATGTCTTGGCTACTGTTTACAACGGGAACTGCAAGTATGACGAGAGCCCCGTGACCAATGTGAGAGGTGACCTGCAAGTGTTGGCCCAGAAGGCGGCAAGAACGCTGCCTACCTCCTTCAATTACGGTGCCGTCAAAGCCACTCGGGTGACTGAACTGCTTTACCGCATGAAGAGGGCCGAAACATACTGCCCCCGGCCTCTTTTGGCTATTCACCCGAGCGAAGCTAGACACAAACAAAAGATCGTGGCGCCTGTGAAACAGCTTTTGAACTTTGACCTGCTCAAGTTGGCAGGAGACGTCGAGTCCAACCCTGGGCCCTTCTTCTCTGACGTCAGGTCAAATCTTTCCAAGTTGGTTGAAACCATCAACCAGATGCAGGAGGACATGTCGGATCCAGGACCGGTGAAGAAACCTGTCGCTTTGAAAGTGAAAGCAAAGAATTTGATTGTCACTGAGAGTGGTGCTCCCCCGACTGACTTGCAAAAGATGGTCATGGGTAACACCAAGCCTGTTGAGCTCATCCTCGACGGGAAGACGGTGGCCATCTGCTGCGCCACCGGAGTGTTTGGTACTGCCTACCTTGTTCCTCGTCATCTTTTCGCAGAGAAGTATGACAAGATCATGTTGGACGGCAGAGCCATGACAGACAGTGACTACAGAGTGTTTGAGTTTGAGATTAAAGTGAAAGGA
CAGGACATGCTCTCAGACGCCGCGCTCATGGTGCTTCACCGTGGGAATCGCGTGCGGGACATCACGAAGCACTTCCGTGATGTGGCAAGAATGAAGAAAGGCACCCCCGTCGTCGGCGTGATCAACAACGCTGATGTTGGGAGACTGATCTTCTCTGGTGAGGCCCTTACCTACAAGGACATCGTAGTGTGCATGGACGGAGACACCATGCCCGGTCTCTTCGCCTACAAAGCCGCCACCAAGGCGGGTTACTGTGGAGGAGCCGTTCTTGCAAAGGACGGAGCCGAGACTTTCATCGTTGGTACCCACTCCGCAGGCGGCAACGGAGTTGGATACTGCTCATGCGTTTCCAGGTCTATGCTGCTTAAAATGAAGGCACACATCGATCCCGAACCACACCACGAGGGATTGATAGTTGACACCAGAGATGTTGAGGAGCGCGTACATGTCATGCGCAAAACCAAGCTCGCACCCACCGTGGCACACGGTGTGTTTAACCCCGAATTTGGGCCTGCCGCCTTGTCCAACAAGGGCCCGCGCCTGAATGAGGGGGTTGTCCTCGATGAAGCCATCTTCTCCAAACACAAAGGAAACACAAAGATGTCTGAGGAGGACAAAGCGCTGTTCCGCCGCTGTGCTGCTGACTACGCGTCGCGTCTACATAGCGTGCTGGGTACGGCAAATGCCCCACTGAGCACTTACGTGGCAATCAAGGGCGTCGACGGACTTGACGCCATGGAACCAGACACCGCGCCTGGTCTCCCCTGGGCTCTCCAGGGGAAACGCCGTGGTGCGCTCATTGATTTCGAGAACGGCACTGTCGGACCCGAGGTTGAAGCTGCCTTGAAGCTCATGGAGAAAAGAGAGTACAAGTTTGTATGCCAGACCTTCCTGAAGGACGAGATTCGCCCGATGGAGAAGGTACGTGCCGGCAAGACTCGCATTGTCGACGTCCTGCCTGTTGAACACATTCTTTACACCAGGATGATGATTGGCAGATTTTGTGCTCAAATGCACTCAAACAACGGACCGCAAATTGGCTCGGCGGTTGGTTGTAATCCTGATGTTGATTGGCAAAGATTTGGCACGCATTTTGCTCAGTACAGAAACGTGTGGGATGTGGACTATTCGGCCTTTGATGCCAACCACTGCAGTGACGCAATGAACATCATGTTTGAGGAGGTGTTCAACACGGATTTCGGGTTCCACCCAAACGCTGAGTGGATCCTGAAAACTCTCGTGAACACTGAACACGCCTATGAGAACAAACGCATCACTGTTGAAGGCGGGATGCCGTCTGGTTGTTCCGCAACAAGCATCATCAACACAATTTTGAACAACATCTACGTGCTCTACGCCTTGCGTAGACACTATGAGGGAGTTGAGCTGGACTCTTACACCATGATCTCCTACGGAGACGACATCGTGGTTGCAAGTGATTACGATCTGGACTTTGAGGCCCTCAAGCCTCACTTCAAATCCCTTGGTCAAACCATTACTCCAGCTGACAAAAGCGACAAAGGTTTTGTTCTTGGTCACTCCATTACCGATGTCACTTTCCTCAAAAGACACTTCCACATGGACTATGGAACTGGGTTTTACAAACCTGTGATGGCTTCGAAGACCCTCGAGGCTATCCTCTCCTTTGCACGCCGTGGGACCATACAGGAGAAGTTGATCTCCGTGGCAGGACTCGCCGTCCACTCTGGACCTGACGAGTACCGGCGTCTCTTTGAGCCTTTCCAGGGCCTCTTTGAGATTCCAAGTTACAGATCACTTTACCTGCGTTGGGTGAACGCCGTGTGCGGTGACGCATTCTAGA实施例3重组质粒转染动物细胞和目的基因的表达将带有两种质粒DNA的JM109大肠杆菌于含Zeomycin(25μg/ml)的低盐LB营养液(NaCl 5g/L)中增殖，按照Invitrogen公司SNAPMidiPrep Kit(Cat NoK1910-01)操作说明提取质粒DNA(浓度300μg/ml)，测定其OD值以确定转染BHK-21细胞与所用的转染试剂比例。在35mm平皿上转染BHK-21细胞，将4μg质粒DNA溶于250礚DMEM培养液中(无胎牛血清和抗生素)，再加入8μL脂质体转染试剂LipofectaminePlusTMReagent(购自Invitrogen公司，Cat No10964-013)，混合后室温放置20min，另将12μL脂质体转染试剂Lipofectamine PlusTMReagent(购自Invitrogen公司，Cat No10964-013)溶于250μL DMEM培养液中(无胎牛血清和抗生素)，室温放置20min，两者混合后于室温放置20min，将混合液缓慢添加到细胞中，37℃孵化5h，移去转染混合液，添加5mL含有10％胎牛血清的营养液，37℃培养24-48h后，收获转染细胞。采用间接免疫荧光法和双抗体夹心ELISA方法检测质粒DNA中FMDV特异基因片段在CMV启动子作用下的表达情况。
间接免疫荧光法检测时收取培养皿中转染细胞生长密度达90％以上的盖玻片，0.01％PBS液漂洗1-2次，冷丙酮-20℃固定30min，0.01％PBS漂洗后吸干液体，滴加1∶800口蹄疫兔阳性血清(本实验室保存)，37℃湿盒中孵化30min，0.01％PBS液漂洗5次，加1∶160的FITC-羊抗兔IgG(购自Sigma公司，Cat NoF0382)，37℃湿盒中染色30min，0.01％PBS液漂洗5次后甘油封片，于Olympus荧光显微镜下观察。结果显示，转染pcDNA3.1/P12X3C的BHK-21细胞中有特异荧光产生，而转染pcDNA3.1(+)的阴性细胞及未转染的空白细胞中未出现特异荧光，说明目的蛋白在BHK-21细胞中正确表达(见图5)。
双抗体夹心ELISA检测时将转染48h后的细胞用灭菌的0.01％PBS洗涤后胰酶消化，收集细胞消化液并离心弃上清，细胞沉淀中加入细胞裂解液(100mM Tris-HCl，pH 8.3-8.6，2％Triton X-100,150nm NaCl，0.6MKCl，5mM EDTA，1％ aprotinin，3mM PMSF，1μg/ml Leupeptin，5μg/mlTrypsin Inhibitor)处理细胞并离心，上清用于ELISA检测。96孔酶标板用1∶800的口蹄疫兔阳性血清(本实验室保存)包埋，4℃过夜，马血清封闭后，将FMDV抗原(本实验室保存)、转染pcDNA3.1/P12X3C的细胞裂解液、转染pcDNA3.1(+)的阴性对照细胞裂解液及未转染的空白对照细胞裂解液以2倍梯度稀释，每个稀释度设两复孔，37℃作用1h后，PBST洗涤，加入1∶1600的口蹄疫豚鼠阳性抗血清(本实验室保存)，37℃作用1h，洗涤后加入1∶2000的HRP-兔抗豚鼠IgG(购自Sigma公司，Cat NoA5545)，37℃作用1h，加入底物OPD-H2O2于37℃作用15min，用终止液(1.25M H2SO4)结束反应，于λ492nm处测定OD值。结果显示，B组与C、D组差异显著(P＜0.01)，而C与D组间的OD值差异不显著(P＜0.05)(见表1)。随着倍比稀释度的提高，B组的OD值和A组的OD值同时逐渐降低，但C组的OD值及D组的OD值变化不大(见图6)。
表1夹心ELISA法检测BHK-21细胞中的目的蛋白表达情况稀释倍数组别Undiluted 1∶21∶41∶81∶16 1∶32 1∶64 1∶128A组1.73±0.01 1.60±0.02 1.51±0.01 1.24±0.01 0.92±0.03 0.73±0.01 0.58±0.04 0.45±0.00B组0.58±0.02 0.50±0.04 0.37±0.01 0.34±0.02 0.22±0.02 0.20±0.00 0.16±0.00 0.13±0.03C组0.18±0.00 0.14±0.01 0.15±0.03 0.13±0.02 0.13±0.02 0.22±0.03 0.16±0.03 0.15±0.05D组0.18±0.09 0.14±0.02 0.15±0.02 0.12±0.00 0.13±0.03 0.17±0.01 0.13±0.00 0.16±0.04A组(阳性对照)细胞培养并用BEI灭活的FMDV；B组(待检样品)pcDNA3.1/P12X3C转染的BHK-21细胞裂解液；C(阴性对照)pcDNA3.1转染的BHK-21细胞裂解液；D(空白对照)未转染的BHK-21cell裂解液。
实施例4体内接种和免疫应答的检测用DPBS缓冲液(Dulbecco’s phosphate buffered saline购自Sigma公司，Cat NoD8537)将提取纯化的两种质粒DNA稀释成浓度为1μg/μl，将其作为DNA疫苗直接注射豚鼠后腿部肌肉内(每只一免时注射200μg质粒DNA，二免时注射400μg质粒DNA)，在第一次免疫后的第1周、2周、3周、4周及第二次免疫后的第1周、2周、3周分别采血，并以免疫前的血清为对照，采用间接ELISA法测其血清中的FMDV特异抗。每组随机采血三只，将豚鼠血清以1∶32稀释，于96孔酶标板上以FMDV疫苗株纯化病毒(本实验室保存)为包被抗原(1∶10稀释)，被检豚鼠血清为一抗，1∶2000过氧化物酶标记的兔抗豚鼠IgG(购自Sigma公司，CatNoA5545)为二抗，于λ492nm处测定每孔的OD值，以空白孔调零。取每组间接ELISA方法测定结果的平均值(见表2)，并将抗体水平的动态变化用曲线图表示(见图7)。表2和图7均显示，除D组和E组外，各免疫组豚鼠的特异性抗体水平在第一次免疫后的第二周明显提高。
表2间接ELISA检测豚鼠血清FMDV特异抗体结果(x±SE)组别A组B组 C组 D组 E组0.2125± 0.1585±0.2040± 0.2445±0.2405±免疫前0.001 0.019 0.033 0.034 0.060第一次免疫 0.3260± 0.3347±0.3567± 0.2663± 0.2543±第一周0.044 0.062 0.057 0.031 0.0170.5053± 0.7237±0.5937± 0.3427± 0.3430±第二周0.046 0.422 0.168 0.025 0.0100.5417± 0.4493±0.2777± 0.2887± 0.2740±第三周0.092 0.234 0.051 0.045 0.0100.9940± 0.3935±0.3055± 0.2670± 0.2840±第四周0.222 0.157 0.025 0.003 0.087第二次免疫 1.4035± 0.4715±0.2500± 0.2165± 0.2445±第一周0.204 0.135 0.044 0.003 0.0291.7225± 0.4095±0.4600± 0.3890± 0.4280±第二周0.161 0.022 0.100 0.059 0.0260.9310± 0.2460±0.2357± 0.2327± 0.2287±第三周0.1210.04 0.049 0.011 0.024A组注射FMD灭活疫苗；B组注射质粒pcDNA3.1/P12X3C；C组注射质粒pcDNA3.1/P12X3C和酵母系统表达并纯化的FMIDV 3D蛋白；D组注射质粒pcDNA3.1；E组注射DPBS缓冲液。
分别将免疫前(第0天)、第一次免疫后第四周(第28天)、第二次免疫后第三周(第49天)的豚鼠血清用于微量中和试验，每组各测两只豚鼠。在微量中和实验中，将生理盐水稀释的豚鼠血清56℃灭活30min后，在96孔微量细胞培养板上，用稀释液(无血清DMEM)作一系列倍比稀释，每个稀释度作4孔，每孔加入50μl病毒液(100TCID50)，37℃温箱中和1小时后每孔加入100μl细胞悬液，置5％CO2培养箱37℃培养，自48小时观察至144小时终判。设置阳性和阴性血清对照、病毒回归实验、血清毒性对照、正常细胞对照。计算出能保护50％细胞孔不产生细胞病变的血清稀释度，该稀释度即为该份血清的中和抗体效价。结果(见表3)显示除D组E组之外，各试验组的中和抗体在第一次免疫后出现，但只有A组豚鼠的中和抗体滴度在二次免疫后进一步提高，B组和C组豚鼠的中和抗体滴度比第一次免疫后的略有降低。
表3.免疫豚鼠中和抗体豚鼠编号A组 B组 C组 D组 E组免疫前1 ＜0.6＜0.6＜0.6＜0.6＜0.6(第0天) 2 ＜0.6＜0.6＜0.6＜0.6＜0.6第一次免疫1 1.5 0.75 0.75 ＜0.6＜0.6(第28天) 2 1.2 0.9 0.9 ＜0.6＜0.6第二次免疫1 2.1 0.75 0.75 ＜0.6＜0.6(第49天) 2 1.5 0.75 0.75 ＜0.6＜0.6A组注射FMD灭活疫苗；B组注射质粒pcDNA3.1/P12X3C；C组注射质粒pcDNA3.1/P12X3C和酵母系统表达并纯化的FMDV 3D蛋白；D组注射质粒pcDNA3.1；E组注射DPBS缓冲液。
T淋巴细胞增殖实验。在免疫前、第一次免疫的第28天、第二次免疫的第21天，无菌采豚鼠脾脏，应用100目铜网无菌条件分离脾脏淋巴细胞，检测动物脾脏T淋巴细胞在植物血凝素(PHA)刺激下的增殖情况(各组设置和上述中和试验相同)。将无菌采集的豚鼠脾脏细胞以RPMI1640培养液(购自Invitrogen公司，Cat No61870-036)稀释成2×107个/毫升，于96孔细胞培养板中，每孔加入50ul细胞悬液和50uLPHA溶液(购自北京欣经科公司，Cat No5030，浓度50ug/ml)，设三复孔，另设对照孔。培养板置37℃、5％CO2饱和湿度条件下培养45小时后每孔加MTT溶液(购自北京欣经科公司，Cat No15029，5mg/ml)10ul，继续培养3小时并以10％SDS-0.01mol/L HCl溶液终止反应，待沉淀溶解后于λ570nm处测定每孔OD值，结果以三个孔平均值表示。结果显示(见图8)除D组和E组之外，各免疫组的脾脏T淋巴细胞均出现增殖反应，其中B组豚鼠的T淋巴细胞在第二次免疫后有所增强，但A组、C组二次免疫后的T淋巴细胞增殖反应有所减弱。采用Anove分析方法对各组豚鼠T淋巴细胞增殖变化进行分析，结果显示A组、B组、C组之间无显著差异，C组、D组、E组之间无显著差异，B组与D组、E组有显著差异。
实施例5接种动物对病毒攻击的保护二次免疫后第三周，于每只豚鼠左后脚掌皮下穿刺及皮内接种0.2ml100倍半数感染量(ID50＝105.5)的O型FMDV China99株，接种后1周内观察发病情况。病变的严重程度分别表示为“无”，即两只后脚掌均无病变；“轻微”，即病变仅发于注射的单只后脚掌；“严重”，即两只后脚掌均出现病变。以病变出现的严重程度作为保护效果的判定完全保护为不出现任何病变，部分保护为病变仅发生于注射的单只脚。保护率(％)＝完全保护的豚鼠数/每组豚鼠总数×100。结果见下表4。
表4豚鼠抗病毒能力检测豚鼠编号A组*B组 C组** D组 E组 F组***保护结果1 完全保护完全保护完全保护无保护无保护无保护2 完全保护完全保护部分保护无保护无保护无保护3 部分保护完全保护部分保护无保护无保护无保护4 部分保护完全保护部分保护无保护无保护无保护病变程度1 无 无 无严重 严重 严重2 无 无 严重 严重 严重 严重3轻微 无 轻微 严重 严重 严重4轻微 无 轻微 严重 严重 严重保护率(％) 50(2/4) 100(4/4)25(1/4) 0(0/4)0(0/4)0(0/4)*两只豚鼠怀孕；**两只豚鼠怀孕；***为健康对照组。
A组注射FMD灭活疫苗；B组注射质粒pcDNA3.1/P12X3C；C组注射质粒pcDNA3.1/P12X3C和酵母系统表达并纯化的FMDV 3D蛋白；D组注射质粒pcDNA3.1；E组注射DPBS缓冲液。
权利要求
1.编码DNA序列，其(优选顺序地)包含口蹄疫病毒(优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒)结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因，优选其具有SEQ ID NO1或2的序列。
2.转录单位，其含有权利要求1的编码DNA序列和与该DNA序列可操作地连接的、在真核细胞(特别是哺乳动物细胞)中表达该DNA序列所必需的表达调控元件(尤其是启动子，如病毒启动子或哺乳动物细胞启动子，和转录终止序列)，优选地，其是序列质粒pcDNA3.1/P12X3C或pcDNA3.1/P12X3C3D所包含的转录单位。
3.真核表达载体，其含有权利要求2的转录单位。
4.权利要求3的表达载体，其是质粒，例如含有权利要求2的转录单位的真核表达质粒，优选地，其是质粒pcDNA3.1/P12X3C或pcDNA3.1/P12X3C3D。
5.构建权利要求3或4的表达载体的方法，包括获得编码口蹄疫病毒(优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒)结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的DNA序列，采用已知技术将编码口蹄疫病毒结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的DNA序列分段克隆到空的真核表达载体(特别是质粒)中，形成能够表达结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的重组表达载体。
6.DNA疫苗，其包含一种或多种权利要求3或4的表达载体和一种或多种可药用载体，优选稀释剂。
7.制备DNA疫苗的方法，包括采用已知技术构建一种或多种权利要求3或4的表达载体，将得到的表达载体与一种或多种可药用载体混合。
8.口蹄疫病毒结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因在制备DNA疫苗中的用途。
9.权利要求2的转录单位或权利要求3的表达载体在制备DNA疫苗中的用途。
10.含有权利要求3的表达载体的宿主细胞，例如原核细胞，如大肠杆菌细胞，和真核细胞，如哺乳动物细胞。
全文摘要
本发明公开了O型口蹄疫病毒DNA疫苗及其研制方法，具体地，涉及包含口蹄疫病毒(优选O型口蹄疫病毒，特别是China99株O型口蹄疫病毒)结构蛋白P1基因和非结构蛋白2A、2B、3C基因以及可有可无的3D基因的DNA疫苗及其制备方法。
文档编号C12N15/63GK1616663SQ20031011560
公开日2005年5月18日 申请日期2003年11月11日 优先权日2003年11月11日
发明者谢庆阁, 刘在新, 郭慧琛 申请人:中国农业科学院兰州兽医研究所