专利名称：复合蛋白酶催化制备生理活性鹿肽及鹿肽产品的应用的制作方法
技术领域：
本发明属于生物化学领域，具体涉及一种应用复合蛋白酶催化的方法水解鹿肉制备具有生理活性的鹿肽产品，以及该鹿肽产品在提高机体免疫力、增强抗疲劳能力及耐缺氧能力等方面的应用。
背景技术：
生理活性肽是当前食品学界研究最为热门的课题，一般由蛋白质经酶作用制得，因原料蛋白、水解酶类、分离精制方法的不同可以到不同的产品；肽类，特别是一些低聚肽不仅有比蛋白质更好的消化吸收性能，最令人兴奋的是人们发现某些肽类还有诸如调节人体生理机能、防病抗病的生理活性，迄今已发现了低抗原、促进脂质代谢、降低胆固醇、促进矿物质的吸收、降血压、抗氧化、提高免疫力等一系列生理功能，并且它们具有较好的酸、热稳定性、水溶性、粘度随浓度变化迟钝等优点，在功能性食品、药品等方面具有广泛的应用前景。活性肽的获得有3种途径，目前用的最多的是蛋白酶水解法。酶水解法是在温和的或者相对温和的条件，通过选择酶的种类，控制反应进程来水解天然蛋白质，得到特定活性肽。
近年来，多肽蛋白质的研究进展十分迅速，许多研究已经描述了多肽的免疫调节、抗氧化、降血压、抗菌以及抗病毒等特性。例如免疫调节肽乳源性免疫调节肽在体外条件下，能刺激鼠腹膜巨噬细胞吞噬绵羊红细胞。静脉注射能增强鼠对肺炎球菌感染的能力。用老鼠巨噬细胞作检测体系，可见免疫活性肽具有刺激巨噬细胞吞噬能力的作用。同样，作为人类食物蛋白的大豆蛋白和大米蛋白通过合适的酶解也可产生具有免疫活性的肽，而且，有些肽除了具有刺激巨噬细胞的吞噬能力外，还能抑制肿瘤细胞的生长。这些免疫活性肽可与肠粘膜结合淋巴组织相互作用，也可自由通过肠壁而直接与外周淋巴细胞发生作用。来源于动物的活性肽可增强巨噬细胞的功能，增加对许多病原的非特异性抗性反应，具有抗肿瘤、抗病毒作用。
我国是梅花鹿生产大国，目前养鹿存栏约50-60万头。鹿产品被公认是具有丰富营养价值和药用功能的产品。但是由于对鹿产品的认识和深加工能力有限，因而限制了鹿产品的发展，尤其是鹿肉的加工利用。鹿肉一直是人们公认的营养丰富美味。长期以来，鹿肉只是作为一种低脂高蛋白的佳肴，大大降低其应用价值。由于鹿肉中所含的蛋白质和生理活性成分与一般动物的不同，经研究证明鹿肉中含有极丰富的氨基酸成分，除了含有非必需氨基酸成分外，还含有人体不能合成而必需从食物中获得的7种必需氨基酸。把鹿肉中蛋白质加以水解，而获得各种大小片段的多肽及氨基酸成分，则可以大大提高产品附加值，满足市场的需要。更为重要的是鹿肉水解肽中所含的生理活性肽具有提高免疫力、耐缺氧、耐疲劳等作用。
发明内容
本发明的目的是提供一种复合蛋白酶催化水解鹿肉蛋白的方法，从而制备出具有提高机体免疫功能、具有提高机体抗疲劳功能和耐缺氧功能的生物活性鹿肽，该活性鹿肽可以广泛用于制备各种保健食品、化妆品及药品。
本发明的复合蛋白酶催化方法包括如下步骤(一)原料预处理1.原材料本发明使用的原材料是健康的梅花鹿经宰杀得到的新鲜或冷冻的鹿肉。
2.预处理将冷冻的鹿肉于冷水中解冻或直接使用新鲜的鹿肉，剔除骨、淋巴以及筋膜和脂肪，用绞肉机绞成肉糜，加入鹿肉重量三分之一的去离子水(蛋白质约为11-13％)，于120-122℃处理15-20分钟，然后用胶体磨绞成肉浆，肉浆通过80目标准筛。
3.各种蛋白酶分别用8-12倍冰水溶解备用。所使用蛋白酶的详细资料见下表
4.配制标准的NaOH溶液(2M)。
(二)酶解1、通过80目标准筛的肉浆加入恒温反应罐中，加热至48-52℃，用标准NaOH溶液调节pH值到6.8-7.2；2、在搅拌中(转速100-130rpm/min)分别加入不同种类的蛋白酶(中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，加入不同的酶会得到具有不同生理活性的鹿肽产品)，用标准NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度在28～33％之间，再加入风味蛋白酶，继续用标准NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度在34～42％之间；3、升高酶解液的温度至114-116℃，维持10-15分钟，迅速将温度降低到室温。
酶水解过程中应用pH-Stat方法控制蛋白质水解度，即在蛋白质水解过程中，用标定浓度的NaOH溶液控制水解液pH值为起始pH值，通过下列公式换算出溶液中蛋白质的水解度。
DH＝(V*N)/(1.36*M)其中DH-鹿肉水解度；V--加入的标准NaOH溶液的体积(L)；N--加入的标准NaOH溶液的摩尔浓度(mol/L)；M--反应体系中新鲜鹿肉的质量(kg)。
(三)固液分离使用离心或者过滤的方法除去残渣，收集上清液，测定可溶性固形物含量(阿贝折射仪或者手持式糖度计)。试验结果表明，使用过滤的方法能够更大限度的去除不溶性物质。
(四)浓缩用减压浓缩的方式浓缩上清液，使可溶性固形物含量达到24-26％。
使用阿贝折射仪或者手持式糖度计监控可溶性固形物的含量。试验结果表明，浓缩后会产生少量絮状沉淀(絮状沉淀是可溶性固形物自身絮凝产生的)，该沉淀不会影响鹿肽的生理活性。此外，可以采用过滤或离心的方法将沉淀清除掉。如果采用过滤的方法，滤液中须加入2-4％的硅藻土；如果使用离心的方法，则离心力要达到8000g以上，离心时间为20分钟。
(五)干燥应用于保健食品的鹿肽可以采用喷雾干燥、冷冻干燥或微波干燥的方法进行干燥，所得到的鹿肽产品为淡黄色到黄色的粉末或者颗粒(干燥方法不同，产品的外观会有所不同)，极易吸潮。所说的喷雾干燥方法为在酶解浓缩液中加入一定量的可溶性淀粉，标准化后进行喷雾干燥；所说的冷冻干燥为酶解浓缩液直接在冷冻干燥设备中进行干燥；所说的微波干燥方法为酶解浓缩液直接在微波干燥设备中进行干燥。
(六)检测本发明采用微量凯氏定氮法检测产品蛋白质含量(七)鹿肽生理活性检测本实验观察了鹿肉水解物对小鼠免疫调节、抗疲劳、耐缺氧生理能力的影响。结果表明，本产品在连续服用15天后，对小鼠的胸腺指数、单核巨噬细胞的吞噬指数均有明显的影响，延长小鼠的耐缺氧时间、游泳时间、降低游泳后和血乳酸值，能够增强小鼠的耐缺氧和抗疲劳能力。揭示了复合酶水解鹿肉得到的鹿肽产品对小鼠具有一定的免疫调节作用和增强抗疲劳和耐缺氧能力的作用。
试验材料1、受试物梅花鹿肉的复合蛋白酶水解物的冷冻干燥粉末(分别为A、B、C三种复合蛋白酶水解物)，由本实验室提供。
2、动物昆明种小鼠体重18-20g，雌雄各半。长春生物制品研究所提供。
3、仪器与药品分析天平(十万分之一)，Cary50紫外分光光度计，250mL磨口瓶，游泳水槽(直径30cm，深40cm)，温度计，秒表。
试验方法各试验组的小鼠随机分为4组，每组的数量相同(10只或20只)，空白组给予蒸馏水，高低剂量组按剂量给予鹿肉水解物，阳性对照给予相应的胸腺肽或西洋参皂苷。各组动物除胸腺肽外(胸腺肽按0.2mL/20g体重尾静脉注射)按0.5mL/20g体重灌胃，每天一次，连续15天，末次给受试物后30min后开始试验。
1、胸腺指数与脾指数的测定 动物连续给样15天后，每鼠称重，颈椎脱臼处死，取胸腺、脾脏称重，分别计算胸腺指数和脾指数(每10g小鼠体重的胸腺或脾脏的毫克数)。
2、单核巨噬细胞的碳粒廓清实验 连续给药15天，于末次给药后30min，尾静脉注射中华墨汁5mL/kg体重。注射后2min及15min眶静脉采血20μL溶于2mL、1g/L Na2CO3溶液中，在721型分光光度计650nm波长处测定OD值，并剖取小鼠肝、脾称重，计算吞噬率K(K＝注射墨汁后两次测量的OD值的对数差/两次的间隔时间)和吞噬指数α 3、小鼠常压耐缺氧实验连续给药15天，末次给受试物后30min，将小鼠置于250mL磨口瓶中，用凡士林封好瓶口，记录小鼠自入瓶开始至死亡的时间，作为小鼠的耐缺氧时间(min)。
4、小鼠负重游泳实验连续给药15天，末次给受试物后30min，将小鼠置于游泳箱中游泳，水深不少于30cm，水温25℃±0.5℃，鼠根尾部负重4％体重的铅皮，记录小鼠自游泳开始至死亡的时间，作为小鼠的游泳时间(min)。
5、小鼠游泳前后血乳酸含量测定末次给予受试物30min后，分别于游泳前和游泳(负重2％于25-30℃60min)休息15min后，眼后静脉丛取血，然后采用硫酸比色法测定血乳酸含量。
试验结果表1、鹿肉水解物A对胸腺指数和脾指数的影响剂量 动物数组别 胸腺指数 脾指数(g/kg.d) (只)空白对照 ---20 0.0188±0.0116 0.0435±0.0117高剂量组 10 20 0.0257±0.0115*0.0472±0.0226**低剂量组 1 20 0.0237±0.0151*0.0361±0.0179**胸腺肽组 0.005 20 0.0314±0.0191*0.0478±0.0212***P＜0.05，**P＞0.05由表1中可以表明鹿肉水解物A对小鼠的胸腺指数有明显的影响，而对小鼠的脾指数没有明显的影响。说明鹿肉水解物有促进免疫器官胸腺的生长的作用，而对脾器官没有影响。表明鹿肉水解物的免疫调节作用可能是通过T细胞来实现的，而与B细胞无关。
表2、饲喂鹿肉水解物A小鼠单核巨噬细胞的碳粒廓清实验剂量动物数组别 吞噬率K 吞噬指数α(g/kg.d)(只)空白对照 --- 200.0036±0.0028 2.7908±1.2152高剂量组 10 200.0181±0.0187 4.2513±1.2205*低剂量组 1 200.0158±0.0133 4.8839±1.8901*胸腺肽组 0.005 200.0090±0.0037 3.7198±0.7721**P＜0.05表2中，饲喂鹿肉水解物A的高剂量组和低剂量组对小鼠的单核巨噬细胞对碳粒的吞噬指数与空白组有明显的差异。
表3、饲喂鹿肉水解物B的小鼠常压耐缺氧实验剂量动物数 P值(与空白组别存活时间(min)(g/kg.d)(只) 比较)空白对照--- 10 29.3077±4.9562高剂量组2.5 10 41.8889±12.0566 0.0437低剂量组0.5 10 32.2000±0.4859 0.0873西洋参皂苷 2.5 10 53.6364±3.8542 0.0125表3的数据表明，饲喂鹿肉水解物B小鼠的高剂量组与空白组能够明显增强小鼠常压下的耐缺氧能力(P＜0.05)，而低剂量组则没有作用。因此在增强耐缺氧活力应服用相对高的剂量。
表4、饲喂鹿肉水解物C小鼠的负重游泳实验剂量动物数 P值(与空白比组别 游泳时间(min)(g/kg.d)(只)较)空白对照--- 106.75±4.03高剂量组2.5 1011.50±5.68 0.021低剂量组0.5 109.80±9.160.050
西洋参皂苷 2.510 16.90±2.85 0.010表4数据表明饲喂鹿肉水解物C的高剂量组和低剂量组能够使小鼠的游泳时间明显延长。并且与鹿肉水解物的给予剂量有一定有关系。
表5、饲喂鹿肉水解物C小鼠游泳前后血乳酸含量测定结果剂量游泳前后血乳酸差值组别 动物数(只)(g/kg.d)(mmol/L)空白对照--- 20 0.8496±0.3722高剂量组2.5 20 0.2876±0.1732*低剂量组0.5 20 0.2756±0.1844*西洋参皂苷 2.5 20 0.2817±0.1915**P＜0.01表明饲喂鹿肉水解物C，能够明显降低小鼠游泳运动后血乳酸的产生率。
上述的实验结果表明，小鼠在一定剂量下连续服用15天后，对小鼠的胸腺指数、单核巨噬细胞的吞噬指数均有明显的影响，延长小鼠的常压下的耐缺氧时间和游泳时间，降低小鼠游泳后的血乳酸值。提示三种鹿肉水解物A、B、C，对小鼠具有一定的免疫调节作用和增强抗疲劳和耐缺氧能力的作用。
本发明采用梅花鹿的鹿肉为蛋白质原料，生产具有生物活性的鹿肽，其优点是不但扩大了生物活性鹿肽的来源，而且提高了鹿肉的价值。
本发明采用复合蛋白酶为催化剂，不但作用条件温和，回收率高，而且利用不同蛋白酶对蛋白质一级结构水解位点的选择作用，通过蛋白酶的不同配比得到具有不同生理活性的鹿肽。
本发明采用pH-Stat方法控制蛋白质水解度，其优点是可以方便的控制蛋白质的水解度，避免温度、原料差异、搅拌速率等因素对水解过程的影响，便于工业应用。
本发明提供三张附1为本发明实例鹿肉水解物A的工艺流程2为本发明实例鹿肉水解物B的工艺流程3为本发明实例鹿肉水解物C的工艺流程图具体实施方式
实例1工艺流程参照附图1预处理的鹿肉浆80公斤投放入反应罐中，搅拌加热至50℃，调节pH值到7.0。在搅拌中(转速120rpm/min)先加入冰水溶解的中性蛋白酶，用标准NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度达到28％，然后加入冰水溶解的风味酶继续进行水解反应，使蛋白质的水解度达到38％，酶解液的温度至115℃，维持15分钟，迅速将温度降低到室温。减压浓缩到固形物含量25％，然后冷冻干燥。即得到具有提高免疫力生理功能的鹿肽8公斤左右(蛋白质回收率为70％左右)。
实例2工艺流程参照附图2预处理的鹿肉浆80公斤投放入反应罐中，搅拌加热至50℃，调节pH值到7.0。在搅拌中(转速120rpm/min)先加入冰水溶解的胰蛋白酶，用标准NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度达到33％，然后加入冰水溶解的风味酶继续进行水解反应，使蛋白质的水解度达到41％，酶解液的温度至115℃，维持15分钟，迅速将温度降低到室温。减压浓缩到固形物含量25％，然后冷冻干燥。即得到具有耐缺氧的鹿肽8.5公斤左右(蛋白质回收率为72％左右)。
实例3工艺流程参照附图3预处理的鹿肉浆80公斤投放入反应罐中，搅拌加热至50℃，调节pH值到7.0±0.1。在搅拌中(转速120rpm/min)先加入冰水溶解的木瓜蛋白酶，用标准NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度达到31％，然后加入冰水溶解的风味酶继续进行水解反应，使蛋白质的水解度达到42％，酶解液的温度至115℃，维持15分钟，迅速将温度降低到室温。减压浓缩到固形物含量25％，然后冷冻干燥。即得到具有抗疲劳生理功能的鹿肽8公斤左右(蛋白质回收率为70％左右)。
实例1、2、3的工艺特点是1.分别采用不同蛋白酶以一定次序水解梅花鹿肉，利用了不同蛋白酶对蛋白质一级结构的识别作用，水解产生具有特定生理活性的多肽片断。
2.用pH-Stat方法控制蛋白质水解度，可以方便的控制蛋白质的水解度，避免温度、原料差异、搅拌速率等因素对水解过程的影响。
3.所得的活性鹿肽可广泛应用于制备具有提高机体免疫力、耐缺氧能力、抗疲劳生理功能的药物、保健品、食品等行业领域。
权利要求
1.一种复合蛋白酶催化制备的生理活性鹿肽，是以鹿肉为蛋白质原料，以蛋白酶作为水解酶，包括原料预处理、酶解、浓缩、干燥、制剂等单元操作，其步骤为(1)将冷冻的鹿肉于冷水中解冻或直接使用新鲜的鹿肉，剔除骨、淋巴以及筋膜和脂肪，用绞肉机绞成肉糜，加入鹿肉重量三分之一的去离子水，于120-122℃处理15-20分钟，然后用胶体磨绞成肉浆，肉浆通过80目标准筛；(2)肉浆放入恒温反应罐中，加热至48-52℃，用标准的2M NaOH溶液调节pH值到6.8-7.2，在转速100-130rpm/min的搅拌速度下加入600-1000u/gPr的中性蛋白酶、800-1200u/gPr的木瓜蛋白酶或1000-1500u/gPr的胰蛋白酶，用标准的2M NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度在28～33％之间，再加入25-30LAPU/gPr的风味蛋白酶，继续用标准的2M NaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度在34～42％之间；再升高酶解液的温度至114-116℃，维持10-15分钟，迅速将温度降低到室温；(3)酶解液经固液分离、浓缩使可溶性固形物含量达到24-26％及干燥后得淡黄色到黄色的粉末或者颗粒鹿肽产品。
2.如权利要求1所述的复合蛋白酶催化制备的生理活性鹿肽，其特征在于可采用离心或者过滤的方法除去残渣，收集上清液，实现固液分离。
3.如权利要求1所述的复合蛋白酶催化制备的生理活性鹿肽，其特征在于用减压浓缩的方式浓缩上清液，使可溶性固形物含量达到24-26％，对浓缩后产生的少量絮状沉淀可以采用过滤或离心的方法将沉淀清除掉，过滤时滤液中须加入2-4％的硅藻土；离心时则离心力要达到8000g以上，离心时间为20分钟。
4.如权利要求1所述的复合蛋白酶催化制备的生理活性鹿肽，其特征在于可以采用喷雾干燥、冷冻干燥或微波干燥的方法进行干燥。
5.权利要求1-4任何一项所述的生理活性鹿肽在用于提高机体免疫力方面的应用。
6.权利要求1-4任何一项所述的生理活性鹿肽在用于增强机体抗疲劳能力方面的应用。
7.权利要求1-4任何一项所述的生理活性鹿肽在用于提高机体耐缺氧能力方面的应用。
全文摘要
本发明涉及一种应用复合蛋白酶催化的方法水解鹿肉制备具有生理活性的鹿肽产品，以及该鹿肽产品在提高机体免疫力、增强抗疲劳能力及耐缺氧能力等方面的应用。该鹿肽产品是以处理过的过80目标准筛的肉浆为原料，在恒温反应罐中加热至48－52℃，用NaOH溶液调节pH值到6.8－7.2，搅拌下加入中性蛋白酶、木瓜蛋白酶或胰蛋白酶，待蛋白质水解度达28～33％后再加入风味蛋白酶，继续用标准的2MNaOH溶液控制反应进程，使蛋白质水解度达34～42％；然后将酶解液升温至114－116℃，维持10－15分钟后迅速将温度降低到室温，经固液分离、浓缩及干燥后得淡黄色到黄色的粉末或者颗粒鹿肽产品。
文档编号C12P21/00GK1552892SQ20031011596
公开日2004年12月8日 申请日期2003年12月19日 优先权日2003年12月19日
发明者冯雁, 张作明, 马吉胜, 李媛媛, 韩四平, 冯 雁 申请人:吉林大学