方式，探宄了建立 表达目的蛋白的CHO细胞株应用于大规模悬浮培养的筛选方法的可行性、有效性、实用性， 并最终建立了简单、廉价、有效的筛选方法。在各细胞株经过前期筛选后，当遇到仍然有 较多基本情况相似的候选细胞株时，运用连续式培养的方式，可以让培养环境长期处于稳 定的状态，这样可以通过干涉实验，对单个条件进行测试，最终同样有效的获得了清晰的数 据，在此基础上对各细胞株进行了明确的筛选，与在此阶段通过类似于随机方式进行的选 择相比，选择出的细胞株其综合情况更适合于大规模悬浮培养，即在进行大规模悬浮培养 时，能够得到更高的蛋白表达产量。最后，通过生物反应器大规模悬浮培养的比较，验证了 应用该过程进行筛选的结果优于原先的选择。以上过程，明确了建立的筛选方法的可行性、 有效性。
[0025] 值得注意的是，运用连续式培养，通气干涉连续式培养，渗透压干涉连续式培养， 对各条件进行测试比较，是本筛选方法的核心。同时，补料批式培养在整个方法中，也是不 可缺少的，两者相辅相成，达到了全面了解各细胞株对于大规模培养适用的综合情况。
[0026] 此外，几者之间又互相融合与弥补各自的优缺点，通过几种方式的互相配合，大大 降低了劳动强度，提高了效率和准确性。在整个筛选过程中，运用的方式方法都非常简单与 廉价，这样的过程，对于大部分研宄机构与企业都有能力进行实施，实用性非常强。
【附图说明】
[0027] 图1是细胞株12和细胞株15进行50L规模的生产罐悬浮培养中补料批示培养活 细胞密度数据比较图，（生物反应器Mobius CellReady 50L)。
[0028] 图2是细胞株12和细胞株15进行50L规模的生产罐悬浮培养中补料批示培养单 位产量数据比较图，（生物反应器Mobius CellReady 50L)。
【具体实施方式】
[0029] 下面将结合本发明实施例，对本发明实施例中的技术方案进行清楚、完整地描述， 显然，所描述的实施例仅仅是本发明一部分实施例，而不是全部的实施例。基于本发明中的 实施例，本领域普通技术人员在没有做出创造性劳动前提下所获得的所有其他实施例，都 属于本发明保护的范围。
[0030] 实施例1 本发明实施例中，表达目的蛋白的CHO细胞株应用于大规模悬浮培养的筛选方法，具 体步骤包括： 1. 初步准备：实验所用的细胞株为CHO细胞（DHFR系统，CH0-DXB11型)，表达FC-融合 蛋白，共15株克隆。
[0031] 这15株克隆已经通过先行工作获得，其过程简介如下： 按照传统的筛选步骤过程，进行载体构建，转染，GHT缺陷选择，然后MTX压力下进行基 因扩增，最后再用有限稀释法在96孔板中进行筛选。（期间使用的培养基均为，不含GHT的 DMEM/F12,并添加 10% 的 FBS。） 进行筛选时使用96孔板（20块板)，获得单克隆，然后进行培养，培养10天后，再取培 养上清用ELISA法测定FC-融合蛋白的表达量，从共1920个板孔中获取整体表达量相对较 高且区别不大的72株克隆，将该72株克隆接种于24孔板中（3块板)，继续进行单个细胞 日产蛋白量（Qp)的比较筛选，从中获取了 Qp值较高的克隆15株，将各细胞株从01~15进 行编号，将这15株克隆进行扩增培养后液氮冻存。
[0032] 由于这15株克隆的Qp值都比较接近，因此，按照传统的筛选方式进行选择的话， 一般随机选择，或者选择表达数据相对较高的那株克隆，值得注意的是这些选择得到的克 隆，其表达数据没有本质上的区别，这也时在大多数项目中经常遇到的现象，这也让筛选过 程达到这一步时出现了随意性。
[0033] 将细胞株15选定为生产用细胞株，准备应用于项目的后续阶段。
[0034] 2.细胞株无血清培养基适应及分批式培养的筛选 已获得的15株表达FC-融合蛋白的CHO细胞株是在含血清培养基中进行培养、转染、 选择、筛选、扩增、冻存的。由于CHO细胞在工业生产的大规模培养应用中，基本上都是进行 无血清悬浮培养的，因此，首先需要对这15株细胞进行无血清培养基适应。
[0035] 2. 1表达目的蛋白的CHO细胞株的无血清培养基适应 2. I. 1无血清培养基适应过程 无血清培养基适应过程中会涉及到两种培养基，其中，含血清培养基为不含GHT的 DMEM/F12, MTX浓度100nm〇l/L，并添加10%的FBS ;无血清培养基为实验者自有的，适用于 CHO细胞大规模悬浮培养的基础培养基W027,其中，MTX浓度也为100nmol/L。
[0036] 1)将15株表达目的蛋白的CHO细胞复苏后，分别接种于含血清培养基中，接种密 度为 1±0. 05X105cells/ml。
[0037] 2)将细胞悬液置于T-25细胞培养瓶内，接种体积为8ml，每株细胞接种2瓶。
[0038] 3) 15株细胞编号分别为：01~15,同株细胞不同培养瓶分别为AO和BO。
[0039] 4)将总共30瓶细胞放置于二氧化碳培养箱内进行静置培养，二氧化碳浓度为 5. 0%〇
[0040] 接种入细胞培养瓶后，此时，由于还是使用了含血清培养基，因此细胞基本为贴壁 生长，即贴于细胞培养瓶底部进行生长，而上清中也会含有及少量的悬浮细胞。培养72至 96小时后，细胞会将整个T-25细胞培养瓶底部基本生长满，此时，将细胞进行传代操作。
[0041] 1)在显微镜下，对每株细胞的两个培养瓶进行观察，在确定没有异常，没有明显差 别后，再任意取其中一瓶进行操作。
[0042] 2)先将上清连同上清中的悬浮细胞移至15ml离心管内。
[0043] 3)用Iml细胞消化液(含胰酶和EDTA)，对细胞培养瓶中的贴壁细胞进行消化，消 化时间约1至2分钟，此时，贴于细胞培养瓶底部的细胞会脱落成悬浮状。
[0044] 4)将15ml离心管内的上清及其中的悬浮细胞移入到细胞培养瓶中，进行吹打混 匀操作。
[0045] 5)将细胞悬液移至15ml离心管中，进行离心操作，离心条件为lOOOrpm，5分钟。
[0046] 6)离心结束后，获取细胞沉淀，将细胞沉淀悬于新鲜培养基中，此时使用的培养基 为50%含血清培养基和50%无血清培养基。
[0047] 7)用培养基将细胞悬液中的活细胞密度调整为2±0. lX105cellS/ml，接种于T-25 细胞培养瓶中，接种体积为8ml，每株2瓶，同株细胞不同培养瓶编号分别为Al和Bl。
[0048] 8)将总共30瓶细胞放置于二氧化碳培养箱内进行静置培养，二氧化碳浓度为 5. 0%，培养温度为37°C。
[0049] 培养48至72小时后，再进行相同的操作，不同的是，这次将最后所用的培养基调 整为25%含血清培养基和75%无血清培养基，然后，继续进行培养。而后，如此循环地进行 培养与操作，逐步调整两种培养基之间的比例。实际操作情况见表1。
【主权项】
1.一种应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白CHO细胞株的筛选方法，其特征在于该 方法的具体步骤为： a. 使用传统筛选方法获得若干个候选细胞株，简要步骤如下：采用的细胞株为CHO细 胞，在无血清悬浮培养进行目的蛋白的表达，根据实际需要，筛选出Qp值符合要求的细胞 株作为种子进行保存； b. 对步骤a所得到的细胞株进行连续式培养筛选，具体步骤如下： b-1.取步骤a所筛选出的细胞株进行复苏操作后，分别接种于无血清培养基中，接种 的密度为1~5X105cellS/ml，得到细胞悬浮液，进行后续的互不干扰的平行培养过程； b-2.将步骤b-1所得各细胞悬液进行摇瓶培养，摇床速度50~150rpm，二氧化碳浓度 3~8%，培养温度35~37°C，培养48~92小时后，在离心条件为800~1500rpm下，离心 分离3~8分钟，取细胞沉淀接种于无血清培养基中，得到接种密度为3±0. 15X105Cells/ ml的细胞悬液； b-3.将b-2步骤所得各细胞悬液进行摇瓶培养，摇床速度50~150rpm，二氧化碳浓度 3~8%，培养温度35~37°C，至活细胞密度达到2~3X106cells/ml ; b-4.将步骤b-2所得各细胞悬液进行离心分离，离心条件为800~1500rpm，3~8分 钟，收集上清，在-25~-15°C条件下，密封保存； b-5.将步骤b-4所得各细胞沉淀悬于无血清培养基中，该无血清培养基的量与步骤 b-2中所使用的无血清培养基体积相同； b-6.将步骤b-5所得各悬浮液进行摇瓶培养，摇床速度50~150rpm，二氧化碳浓度 3~8%，培养温度35~37°C，培养20~28小时后，取样计量活细胞密度； b-7.取步骤b-6所得悬浮液重复步骤b-4到步骤b-6,至活细胞密度达到稳定值，进入 连续式培养的稳定期，维持稳定期操作3~10天； b-8.检测各上清液中的每20~28小时的目的蛋白的单位产量，按实际需要筛选出蛋 白单位产量符合要求的细胞株； c. 对步骤b筛选出的各细胞株的悬浮液进行通气干涉连续式培养筛选，具体步骤如 下： C-1.在20~30ml/min的流速通入空气的条件下，重复步骤b-4到步骤b-6,到活细胞 密度达到稳定期后3~10天； c-2.调整通气量，增幅为20~30ml/min，并重复步骤b-4到步骤b-6,到活细胞密度达 到稳定期后3~10天； c-3.重复步骤c-2,直至细胞群全部死亡； c-4.根据能够重复步骤c-2的次数和实际需要，筛选出符合要求的细胞株； d. 对步骤c所筛选出的各细胞株进行渗透压干涉连续式培养筛选，具体步骤如下： d-1.实行步骤b-1到b-7的操作，不保存上清； d-2.调整其渗透压值，增幅为40± lOmOsm/kg，在新的渗透压条件下，重复步骤b-4到 步骤b-6,不保存上清，到活细胞密度达到稳定期后3~10天； d-3.重复步骤d-2，直至细胞群基本全部死亡； d-4.根据能够重复步骤d-2的次数和实际需要，筛选出符合要求的细胞株； e. 对步骤d中所筛选出的各细胞株进行补料批式培养筛选，最后筛选出符合要求的 细胞株。
【专利摘要】本发明涉及一种应用于大规模悬浮培养的表达目的蛋白CHO细胞株的筛选方法。本发明方法通过连续式培养、通气干涉连续式培养、渗透压干涉连续式培养、补料批式培养的实验方法，进一步了解了各细胞株的综合情况，最终选择出综合情况最合适进行大规模培养的细胞株。通过几种方式的互相配合，大大降低了劳动强度，提高了效率和准确性。在整个筛选过程中，运用的方式方法都非常简单与廉价，这样的过程，对于大部分研究机构与企业都有能力进行实施，实用性非常强。
【IPC分类】C12N5-02, C12N5-10
【公开号】CN104862280
【申请号】CN201510290161
【发明人】王海华, 文铁桥
【申请人】上海大学
【公开日】2015年8月26日
【申请日】2015年5月29日