一种发酵分离耦合生产长链二元酸的方法
【技术领域】
[0001]本发明的技术方案属于发酵工程技术领域，具体涉及一种发酵分离耦合生产长链二元酸的方法。
【背景技术】
[0002]长链二元酸是合成香料、工程塑料、热熔胶、涂料、润滑油、树脂和医药等的重要原料。
[0003]目前，长链二元酸主要采用微生物发酵法生产，利用微生物双端氧化的特殊功能发酵正烷烃制取长链二元酸。目前国内外生产菌株的ω-氧化能力较强，产酸可达200g/L，但在生产长链二元酸过程中面临的一个首要问题是发酵效率低。中国专利CN1233658A公开了一种生产长链二元酸的热带假丝酵母菌的筛选方法。该方法能快速而高效的获得α、ω-氧化能力强的假丝酵母突变菌株，为提高产酸量和转化率打下基础。长链二元酸在提取前需先对发酵液进行预处理，如专利CN1570124A是将发酵液加碱调节ρΗ8_12，加热到60-100°C，然后利用破乳分层法去除发酵液中的菌体及残留的脂肪酸，该过程分离获得的菌体失了活性，无法在发酵过程中重复利用。CN101225411A、CN1928100A和CN1928100A等也是在发酵结束后，进行破乳分层，上层油回收再利用，放出中间清液，下层菌体再处理一次分离出清液和菌体。
[0004]因此，基于循环使用发酵获得的活性菌体，降低培养细胞的物质消耗，并针对目前发酵结束后分离清液和油层的特点，本专利开发一种发酵分离耦合生产长链二元酸的新技术，采用离心机或板框将具有活性细胞的从发酵液中分离出来，在发酵过程中循环使用，而获得清液按目前的二元酸提取工艺进行。采用该技术既降低了培养细胞的物质消耗，也提高了发酵过程的菌体密度，提高发酵效率。
【发明内容】
[0005]本发明所解决的技术问题是:发酵过程中利用分离耦合装置回流菌体并分离出已合成的高浓度二元酸，降低产物二元酸酸对其合成过程的抑制作用，提高发酵过程的菌体密度，缩短发酵周期，提高合成二元酸的生产强度。
[0006]本发明解决该技术问题所采用的技术方案是:
[0007]1.一种发酵分离耦合生产长链二元酸的方法，包括如下步骤:
[0008](I)将维斯假丝酵母ipe-1 (Candidaviswanathii ipe_l)培养成的种子液接入pH5.0-8.5含有5-40% (v/v) 10-18个碳原子的正烷烃和95-60% (v/v)包括糖质多元底物做生长碳源的液体发酵培养基混合液中；液体发酵培养基包括:糖质10-90g/L,金属磷酸盐 2-10g/L，酵母膏 l_6g/L，玉米浆 l-3g/L，尿素 0.5-1.5g/L，NaCl0.5-lg/L，钾盐 1-1Og/L，吐温 0.5-1.5g/L ；
[0009](2)上述混合液在24_40°C、通气量0.1-3.0vvm下发酵42_194h，启动离心分离耦合装置或板框过滤分离耦合装置，采用分批补料发酵、半连续发酵或连续发酵的形式，经分离耦合装置后的细胞循环回发酵罐，经分离耦合装置后的清液进入提取环节制备长链二元酸，同时向发酵罐中补充液体发酵培养基继续发酵过程；
[0010](3)在上述发酵过程中，通过连续或间歇的方式补加正烷烃，使发酵液中正烷烃浓度始终大于等于1% (v/v)。
[0011]本专利米用的维斯假丝酵母ipe_l (Candida viswanathii ipe_l)已在2014年2月18日保藏于中国微生物菌种保藏管理委员会普通微生物中心(地址:北京市朝阳区北辰西路I号院3号中国科学院微生物研究所)，菌种编号CGMCC N0.8824。
[0012]为实现上述步骤，离心分离耦合装置采用了间歇式离心分离耦合装置和连续式离心分离耦合装置。不同的分离耦合装置针对不同的发酵过程，如连续离心分离耦合装置适用于连续发酵、半连续发酵和分批补料发酵，间隙式离心分离耦合装置和板框分离耦合装置适用于半连续发酵。这里所述的所述的分批补料发酵指的是发酵过程中通过连续或间歇的方式补加正烷烃和液体发酵培养基的混合液或仅补充正烷烃，直至发酵罐允许最大体积，当发酵罐中产物浓度未达到其最大发酵浓度时，采用分离耦合装置移除一定的发酵体积直至发酵初始体积，之后继续补料发酵过程，该过程反复进行，直至达到产物最大发酵浓度时终止该发酵过程；所述的半连续发酵指的是在发酵进行42-194h时，通过分离耦合装置移除产物二元酸，直至分离耦合装置死体积时，采用0-3倍耦合死体积的无菌水洗涤菌体，然后将菌体全部返回发酵罐中并一次性补加步骤(I)中的包括烷烃和液体发酵培养基的发酵成份，继续发酵过程，该过程反复进行；所述的连续发酵指的是发酵进行42-194h时，通过分离耦合装置移除已合成的二元酸，同时连续向发酵体系内补充权利要求1中的液体发酵培养基，以连续或间歇的方式补加正烷烃，并以维持发酵液体积恒定、维持发酵液中残留二元酸浓度恒定或维持发酵液中残留烷烃浓度恒定的方式连续进行发酵过程；
[0013]该技术对不同菌种转化含有10-18个碳原子正烷烃或其混合物，进而合成相应的二元酸均有显著效果，特别是对于转化含有12-17个碳原子正烷烃或其混合物的效果更显著。
[0014]本发明与现有技术相比，有益效果是:第一，采用分离耦合装置使发酵过程的二元酸移出发酵体系，降低产物抑制作用；第二，采用分离耦合装置使发酵过程的菌体回流至发酵过程，提高发酵体系的菌体密度，缩短发酵周期；第三，实现了细胞的循环使用，降低了发酵前期培养细胞的物质消耗和培养时间，提高了二元酸的底物转化率。
【具体实施方式】
[0015]下面结合实施例对本发明做进一步说明，本发明所涉及的主题保护范围并非仅限于这些实施例。
[0016]实施例1
[0017]本实施例为不添加发酵与分离耦合装置的发酵过程，作为添加发酵与分离耦合装置的对照，发酵合成长链二元酸的过程如下:
[0018]第一步，培养基配制
[0019]①斜面培养基:麦芽汁琼脂培养基；
[0020]②种子培养基:葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏lg/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，正十二烷 100mL/L ；
[0021]③发酵培养基:葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏lg/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L，NaCl lg/L, KCl lg/L,正十二烷 300mL/L，吐温 801g/L。
[0022]第二步，菌种活化
[0023]取一环维斯假丝酵母(Candida viswanathii ipe_l)母涂布在20X 180mm的大试管固体斜面培养基上，于27°C培养72h。
[0024]第三步，种子培养
[0025]将斜面上活化的种子培养物接种于装10ml种子培养基的500ml三角瓶中，在27°C,200r/min条件下振荡培养40小时。
[0026]第四步，接种发酵
[0027]将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始PH6.0，温度27°C，通气量1.0vvm，通过连续或间歇的方式补加正十二烷，使发酵液中正十二烷浓度始终大于等于1% (v/v),培养42h产酸60.5g/L，培养194h时产酸210g/L发酵结束，平均产酸速率为1.08g/h.L0
[0028]实施例2
[0029]按如下步骤发酵合成长链二元酸:
[0030]第一步，培养基配制
[0031]同实施例1
[0032]第二步，菌种活化
[0033]同实施例1
[0034]第三步，种子培养
[0035]同实施例1
[0036]第四步，接种发酵
[0037]将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始PH6.0，温度27°C，通气量1.0vvm，培养42h。启动发酵分离耦合装置使菌体经耦合装置回流至发酵罐中，经过耦合装置后的清液进入提取环节。当发酵罐中DC浓度小于1g/L时，降低清液引出的速率；当发酵罐中DC>50g/L时，提高清液引出的速率；此过程通过补充新鲜的培养基控制发酵罐内体积恒定，新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏lg/L，玉米浆2g/L，尿素0.5g/L, NaCl lg/L, KCl lg/L,吐温801g/L。此过程选用连续离心分离耦合装置的离心机是管式离心机，操作转速是3000rpm。发酵300h，DC12平均产酸速率分别是2.0g/h.L，较对照提高1.85倍，长链二元酸平均浓度28.2g/L。
[0038]实施例3
[0039]按如下步骤发酵合成长链二元酸:
[0040]第一步，培养基配制
[0041]同实施例1
[0042]第二步，菌种活化
[0043]同实施例1
[0044]第三步，种子培养
[0045]同实施例1
[0046]第四步，接种发酵
[0047]将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始PH6.0，温度27°C，通气量1.0vvm，培养194h。启动发酵分离耦合装置使菌体经耦合装置回流至发酵罐中，经过耦合装置后的清液进入提取环节。当发酵罐中DC浓度小于1g/L时，降低发酵液引出的速率；当发酵罐中DC>50g/L时，提高发酵液引出的速率；此过程通过补充新鲜的培养基控制发酵罐内体积恒定，新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏 lg/L，玉米浆 2g/L，尿素 0.5g/L，NaCllg/L，KCllg/L，吐温 801g/L。此过程选用连续离心分离耦合装置的离心机是管式离心机，操作转速是3000rpm。发酵450h，DC12平均产酸速率分别是1.8g/h.L，较对照提高1.67倍，长链二元酸平均浓度35.lg/L。
[0048]实施例4
[0049]按如下步骤发酵合成长链二元酸:
[0050]第一步，培养基配制
[0051]同实施例1
[0052]第二步，菌种活化
[0053]同实施例1
[0054]第三步，种子培养
[0055]同实施例1
[0056]第四步，接种发酵
[0057]将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5L发酵罐中，初始PH6.0，温度27°C，通气量1.0^111，培养4211。启动分离耦合装置使菌体经分离耦合装置回流至发酵罐中，经过耦合装置后的清液进入提取环节。当发酵罐内溶液体积降低至仅能满足耦合装置运转所需时，用耦合装置死体积3倍的无菌水洗涤菌体，之后将菌体返回发酵罐中，停止耦合装置。此后向发酵罐内补充新鲜的培养基至发酵初始体积，继续发酵。新鲜培养基中包括葡萄糖20g/L，磷酸氢二钠2g/L，酵母膏lg/L，玉米浆2g/L，尿素
0.5g/L,NaCllg/L, KCllg/L,吐温801g/L。当发酵罐中DC12浓度大于210g/L启动耦合装置重复上述过程，此过程反复进行。此过程选用连续离心分离耦合装置的离心机是管式离心机，操作转速是3000rpm，发酵300h时DC12生产强度分别是2.0g/h.L,较对照提高1.85倍，DC12平均浓度180.0g/L。
[0058]实施例5
[0059]按如下步骤发酵合成长链二元酸:
[0060]第一步，培养基配制
[0061]同实施例1
[0062]第二步，菌种活化
[0063]同实施例1
[0064]第三步，种子培养
[0065]同实施例1
[0066]第四步，接种发酵
[0067]将第三步制得的培养物以10%的接种量接种于装3L发酵培养基的7.5