一种快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置及应用
【技术领域】
[0001]本发明属于生物检测技术领域，涉及核酸扩增技术和侧向层析技术等多项技术集成的生物技术领域，尤其涉及一种快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置及应用。
【背景技术】
[0002]近年来，随着社会发展和生物医学技术的进步，每年进行的多种样品核酸检测数量都在大幅增加，对现场快速检测处理速度的各项要求越来越高，现场操作要求灵敏度高。简便快捷的需求也日益迫切。
[0003]自1985年美国PE-Cetus公司的K.B Mullis等人首创了 PCR技术之后，它以相当惊人的速度被广泛地应用于医学及分子生物学等各个领域。近20年来PCR技术在生物医学等各个研究领域和临床应用中发挥了重大的作用。现今，PCR技术已成为一种对标本中特定的DNA片段进行分析研究和检测鉴定的重要方法。几乎所有涉及到分子生物学核酸的研究都要用到PCR，在病原体鉴定、遗传病诊断、免疫学研究、癌基因探索及治疗等方面都作出了相应的贡献。
[0004]PCR产物是否为特异性扩增，其结果是否准确可靠非常重要，必须对其进行严格的分析与鉴定，才能得出正确的结论。PCR产物的分析，可依据研究对象和目的不同而采用不同的分析方法。凝胶电泳分析:目前PCR检测主要用琼脂糖、聚丙烯酰胺电泳产品，琼脂糖电泳检测虽然比较简单，但需要EB溴乙锭染色，紫外灯下观察，检测的灵敏度在ng级，需要标准的Marker进一步判断产物的特异性；聚丙烯酰胺电泳胶体制备过程比较复杂，之后的显色过程也比较复杂，整个检测时间耗时长。
[0005]LAMP技术最早由日本科学家Notomi等(2000)建立，通过针对靶基因的6个区域而设计4种特异性引物，利用具有链置换活性的Bst DNA聚合酶，在恒温条件下^0-65°C)高效(0.5-lh)扩增目标DNA。与目前广泛流行的PCR核酸扩增技术相比，该技术具有不依赖温度循环仪(PCR)等昂贵仪器，且灵敏度高，特异性好，反应速度快等优点。因此，已作为一种新兴技术用于临床疾病诊断、流行性细菌或病毒的现场快速检测、动物胚胎性别鉴定及基因芯片开发等领域。在病毒检测领域，目前已依托LAMP技术开发出用于快速诊断检测包括乙肝肝炎病毒、流感病毒、SARS冠状病毒、单纯疱疹病毒在内的多种流行病毒的方法(Hong et al., 2004 ；Enomoto et al., 2005 ；Kaneko et al., 2005 ;)。在细菌检测领域，该技术也广泛应用于结核分支杆菌、大肠杆菌、肺炎链球菌、痢疾志贺菌的快速检测(Iwamotoet al.，2003)。基于Y染色体上特异序列的差异，Hirayama等(2004)利用LAMP技术开展了对牛早期胚胎性别的快速检测，将LAMP技术应用到了一个全新的领域。
[0006]自PCR和LAMP发明以来，实现了核酸的特异性扩增以来，得到了广泛的应用，但是由于高灵敏、高特异性和高效性，导致假阳性结果出现。造成假阳性实验失败的原因很多:1.样品间交叉污染:样本污染主要有收集样本的容器被污染，或样本放置时，由于密封不严溢于容器外，或容器外粘有样本而造成相互间交叉污染；样本核酸模板在提取过程中，由于吸样枪污染导致标本间污染；2.试剂的污染:主要是由于在试剂配制过程中，由于加样枪、容器、双蒸水及其它溶液被PCR核酸模板污染。3.扩增产物污染:这是扩增反应中最主要最常见的污染问题。极微量的PCR产物污染，就可形成假阳性。4.气溶胶污染:在空气与液体面摩擦时就可形成气溶胶，在操作时比较剧烈地摇动反应管，开盖时、吸样时及污染进样枪的反复吸样都可形成气溶胶而污染。5.实验室中克隆质粒的污染:由于克隆质粒在单位容积内含量相当高，另外在纯化过程中需用较多的用具及试剂，而且在活细胞内的质粒，由于活细胞的生长繁殖的简便性及具有很强的生命力，其污染可能性也很大。在分子生物学实验室及某些用克隆质粒做阳性对照的检验室，这个问题比较常见。
[0007]尤其随着LAMP技术的日益发展，两个阻碍其在基层的应用推广的瓶颈问题也逐渐凸显出来；首先是LAMP的灵敏性带来的气溶胶污染问题，由于LAMP方法对于靶序列的扩展灵敏且扩增量大，为应对这一问题，对于LAMP技术目前在实际应用过程中一般要求“要严格分区，规范操作”，即，根据LAMP操作流程将实验区分为“样品处理区，溶液配制区，模板添加区，检测区”，而且在操作过程中要严格按照模板最后加入，先阴性、后阳性，从低到高的浓度进行操作。对于这样严格苛刻的要求，在实际基层使用过程中很难做到，进而使得该技术在基层现场检测中难于推广。其次是现场检测的结果证据可视化，为了使用结果一目了然，要有更方便的可视化检测系统。
[0008]由此可以看出，在检测环境要求苛刻的现场或野外进行核酸分子快速检测时，如何合理的避免检测过程中的气溶胶污染，同时又能解决核酸分子样品检测中的现场检测结果证据的可视化问题，成为能否使得核酸分子快检检测更好的服务于基层检测单位的一个绕不开，也躲不过的问题。
【发明内容】
[0009]本发明所要解决的一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种能避免检测过程中的气溶胶污染的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置。
[0010]本发明所要解决的另一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种使用上述的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置在非诊断目的环介导等温扩增与核酸侧向层析流动试纸条结合快速检测靶核酸扩增产物方法中的应用。
[0011]本发明所要解决的又一个技术问题是针对现有技术的现状提供一种使用上述的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置在非诊断目的防止核酸扩增产物污染、避免气溶胶污染方法中的应用。
[0012]本发明所要解决的一个技术问题使用上述的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置在食品致病菌检测以及农业、工业、海关、牧业在基因水平上的种类鉴定、基因突变检测中的非诊断目用途中的应用。
[0013]本发明解决上述技术问题所采用的技术方案为:该快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置，其特征在于:包括从上至下依次套设的反应管、取样混样器和反应指示盒，其中:
[0014]所述反应管，具有可密闭的管盖；
[0015]所述取样混样器，包括管套和能密封所述管套开口的上盖，且所述管套中部具有能割破所述反应管的切割物，在所述反应管盖上管盖并置入取样混样器中的状态下，所述反应管能轻靠于所述切割物上，而在紧扣所述取样混样器上盖的状态下，所述反应管能沿着所述取样混样器的内管壁向下移动4?5毫米，最终使得所述取样混样器中的切割物能划破所述反应管的底部；
[0016]所述反应指示盒，其中部具有能刺破所述取样混样器的尖锐凸起物，所述尖锐凸起物的外周面设置有至少一个缺口，而所述反应指示盒的尾端具有能容纳侧向层析试纸条的容腔，且在所述容腔的末端开口适配有后盖。
[0017]作为优选，所述切割物的切割角度介于30°?60°。
[0018]所述反应指示盒的端部具有内螺纹，相对应地，所述取样混样器的末端则具有外螺纹，且该取样混样器的末端还适配有密封圈。在取样混样器末端的外螺纹螺接在反应指示盒端部内螺纹的状态下，能将取样混样器固定在反应指示盒内，并能利用密封圈将取样混样器密封固定在反应指示盒内。
[0019]进一步地更好地实现反应管固定在取样混样器内，所述取样混样器的管套向内延伸有能支承所述反应管的环形凸圈。
[0020]本发明公开了一种使用上述的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置在非诊断目的环介导等温扩增与核酸侧向层析流动试纸条结合快速检测靶核酸扩增产物方法中的应用。
[0021]本发明还提供一种使用上述的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置在非诊断目的防止核酸扩增产物污染、避免气溶胶污染方法中的应用。
[0022]本发明还公开了一种使用上述的快速鉴定核酸扩增产物的密闭实验系统装置在食品致病菌检测以及农业、工业、海关、牧业在基因水平上的种类鉴定、基因突变检测中的非诊断目用途中的应用。
[0023]与现有技术相比，本发明具有如下优点:上述方法中扩增反应结束后，不打开反应管的管盖，可以避免靶核酸扩增产物释放空气中形成严重的气溶胶污染，扩增产物在这个完全密闭的装置内可以利用反应指示盒内的核酸侧向层析流动试纸条进行荧光检测，其优点在于只需要在一个引物上标记生物素和FITC探针，核酸扩增反应后可在5-15min分钟内完成核酸扩增产物检测，并能鉴别产物特异性，灵敏度为Pg级，杂交后即可显示特定基因的显示结果，具有直观可视化，快速的优势和便捷；检测后不打开密封的装置，可将其全部废弃于安全处；整个过程在密闭环境中进行，能有效地防止靶核酸扩增物交叉污染，避免假阳性；应用本发明的装置可在医药卫生、食品安全以及日常实验中快速分析和检测核酸扩增产物，判断待检目标物是否含有假阳性，如假冒食品溯源地，食源性致病菌检测，食品中转基因检测，假冒特定肉类产品的检测等等类型，因此非常值得在现场推广和应用。
【附图说明】
[0024]图1本发明实施例1中的一个角度的结构示意图；
[0025]图2本发明实施例1中的另一个角度的结构示意图；
[0026]图3图2的A-A向剖面示意图；
[0027]图4本发明实施例1中反应管未插入取样混样器的结构示意图；
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