一种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于天然药物化学领域，具体涉及一种应用高速逆流色谱法分离纯化石杉 碱丙的方法。
【背景技术】
[0002] 阿尔茨海默病（Alzheimer)是一组原因未明的原发性脑变性疾病，常起病于老年 或老年前期，多缓慢发病，并逐渐进展，最终以痴呆为主要表现。随着我国人均期望寿命的 提高和老龄化社会的步步逼近，阿尔茨海默病开始大面积地出现在我国老年人群中，对患 者及其家庭产生了严重危害。截至2012年底，我国60岁及以上老年人口已达1. 94亿，占 总人口的14. 3%，预计2013年将突破2亿，2034年突破4亿。而据有关资料显示，60岁以 上阿尔茨海默病的患者占老龄人口的6%，阿尔茨海默病已成为一个严重的社会问题。因 此，寻找和创制对阿尔茨海默病具有显著疗效的新型药物意义重大。
[0003] 临床实验早已证实石杉碱甲（Huperzine A)治疗阿尔茨海默病的疗效显著，但近 年来，由于提取石杉碱甲高额利润的驱使，人们对蛇足石杉地毯式的采收使得该类植物锐 减，除了寻找生产石杉碱甲的新途径外，充分利用蛇足石杉资源，挖掘与石杉碱甲等效的石 松生物碱势在必行。石杉碱丙（Huperzine C)作为一种与石杉碱甲结构相近的Iycodine 型生物碱，其AchE活性抑制能力接近石杉碱甲，但由于其含量较低、获得难度较大而未得 到足够的重视。
[0004] 高速逆流色谱（HSCCC)是基于流体动力学平衡而发展起来的色谱技术。它的固定 相和流动相由互不相溶的溶剂体系的上下相组成，依据特殊的离心力场将固定相保留在分 离柱内，流动相由液相栗带动，不断穿过固定相完成高效、快速、多次、连续萃取。目前HSCCC 已在天然产物分离领域获得了巨大成功。而现有文献中未见有应用高速逆流色谱分离纯化 石杉碱丙的报道。
[0005] 针对上述问题，本发明公开了一种应用高速逆流色谱技术分离纯化石杉碱丙单体 化合物的方法。
【发明内容】
[0006] 本发明的目的是提供一种快速、高制备量地分离制备高纯度石杉碱丙的方法，所 述方法高效快速，操作简便。
[0007] 本发明的分离制备方法是通过如下的技术方案实现的：
[0008] -种高速逆流色谱分离制备高纯度石杉碱丙的方法，包括如下步骤：
[0009] A、分离的两相溶剂系统由正己烧、乙酸乙酯、甲醇和水3~5:6:3~5:6混勾后分 层得到；
[0010] B、将两相溶剂体系的上相作为固定相，下相作为流动相；
[0011] C、将固定相栗入至逆流色谱柱内，然后开动主机，并按设定转速开启旋转，再向柱 内栗入流动相；待两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡；
[0012] D、然后将包含石杉碱丙的样品溶于两相溶剂体系的下相；通过进样阀将样品溶液 注入至逆流柱内；
[0013] E、收集高纯度石杉碱丙馏分。
[0014] 上述A步骤中正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照体积比为2:3:2:3混合得到。
[0015] C步骤中栗入固定相时的流速为20-50mL/min，栗入流动相时的流速为1.2~ 2. OmT,/mi n 〇
[0016] C步骤中高速逆流色谱的主机转速为800~900rpm。
[0017] 优选C步骤中栗入流动相时的流速为I. 5mL/min ;高速逆流色谱的主机转速为 900rpm〇
[0018] 上述方法的操作温度为25~35 °C，优选25 °C。
[0019] 上述方法使用紫外检测器作为高速逆流色谱的检测器，检测波长为254~365nm。 优选检测波长为254nm。
[0020] D步骤中所述的包含石杉碱丙的样品为蛇足石杉提取物。
[0021] D步骤中包含石杉碱丙的样品溶于两相溶剂体系的下相中的浓度为10-40mg/mL。
[0022] 本发明所述方法使用的原料为中药蛇足石杉提取物，系参考专利（【申请号】 200410084633. 1)从蛇足石杉中提取得到的生物碱复合成分。
[0023] 本发明采用自动馏分收集器接收馏分；分离完成后，采用高效液相色谱对收集的 馏分进行纯度检测；合并纯度较高的包含石杉碱丙的馏分；随后使用旋转蒸发除去合并馏 分中的溶剂，得到石杉碱丙固体；高效液相色谱分析测得最终分离得到的石杉碱丙的纯度 为 93%。
[0024] 本发明首次利用高速逆流色谱技术分离纯化得到高纯度的石杉碱丙，该方法具有 操作简单、高效快速、制备量大及纯度高等优点，是一种适于大量制备生产高纯度石杉碱丙 的方法。
【附图说明】
[0025] 图1为实施例1分离石杉碱丙的高速逆流色谱图；
[0026] 图2为实施例1分离得到的石杉碱丙的高效液相色谱纯度分析图；
[0027] 图3为对比例2分离石杉碱丙的高速逆流色谱图；
[0028] 图4为对比例2分离得到的石杉碱丙的高效液相色谱纯度分析图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合实施例对本发明作进一步的描述，以使本发明的优点和特征能更易于被 本领域技术人员理解，从而对本发明的保护范围做出更为清楚明确的界定。
[0030] 下述实施例中所使用的实验方法如无特殊说明，均为常规方法。
[0031] 下述实施例中所用的材料、试剂等，如无特殊说明，均可从商业途径得到。
[0032] 实施例1 :
[0033] 高速逆流色谱法分离纯化蛇足石杉粗提物中的石杉碱丙。
[0034] 1.样品的制备：使用中药蛇足石杉提取物作为本实施例的样品，该样品是参考专 利（【申请号】200410084633. 1)从蛇足石杉中提取得到，是一生物碱复合物，包含石杉碱丙 以及石杉碱甲、石杉碱乙等。利用旋转蒸发仪除去粗提物的溶剂后，得到粗提物浸膏。
[0035] 2.两相溶剂体系的制备：将正己烷、乙酸乙酯、甲醇和水按照2:3:2:3( V:V)的比 例充分混合均匀后，将上、下相分层，并分别使用超声脱气30min，除去溶剂中的气泡。
[0036] 3.样品溶液的配制：取步骤1中得到的浸膏200mg溶解于5mL两相溶剂体系的下 相。
[0037] 4.仪器：本实施例使用的高速逆流色谱仪为上海同田生物技术有限公司生产的 TBE-300B，纯度分析中使用的高效液相色谱仪为美国戴安公司生产的Ultimate 3000。
[0038] 5.高速逆流色谱分离：将固定相以20mL/min的流速栗入到逆流色谱柱内，待固定 相充满逆流柱后开动主机，设定转速900rpm，待转速达到设定的转速后，以I. 5mL/min的流 速向柱内栗入流动相；当两相溶剂体系在逆流柱中达到动态平衡后，通过进样阀将5mL样 品溶液注入至逆流柱内；分离过程中使用紫外检测器对馏分进行检测，波长设定为254nm， 采用色谱工作站对数据进行采集与处理，同时采用自动馏分收集器接收馏分，4min每管； 所得到的高速逆流色谱图如图1所示，从图中可以看出粗提物中成分较为复杂，而石杉碱 丙与其他化合物有较好的分离度。
[0039] 6.纯度分析：分离完成后，采用高效液相色谱对收集的馏分进行纯度检测，以 石杉碱丙的峰面积占总峰面积的百分比来考察分离得到的馏分纯度；色谱分析的条件 为：色谱柱 Waters Spherisor0DS2(250mmX 4.6mm i.d.，5 y m)，柱温 30°C，流动相为乙 腈：0. 4%的醋酸水溶液体积比40:60,流速为1.0 mL/min，进样量为10