人源化的抗-d因子抗体的制作方法
【专利说明】人源化的抗-D因子抗体
[0001] 本申请是申请日为2007年10月31日、申请号为200780048936.X、名称为"人源 化的抗-D因子抗体"的发明申请的分案。
[0002] 发明背景
[0003] 补体系统在免疫复合物的清除以及在对感染试剂、外来抗原、病毒-感染细胞和 肿瘤细胞的免疫应答中起着重要作用。然而，补体还参与病理性的炎症以及自身免疫疾病。 因此，对过度或不受控制的补体级联激活加以抑制可以对患有这样的疾病和病情的患者提 供临床益处。
[0004] 补体系统包括两个不同激活途径：经典途径和旁路途径（V.M.Holers，In ClinicalImmunology:PrinciplesandPractice,R.R.Rich编辑,MosbyPress； 1996, 363-391)。经典途径为钙/镁-依赖的级联，其通常由抗原-抗体复合物的形成激 活。旁路途径为镁-依赖的级联，其通过某些易感表面（例如酵母和细菌的细胞壁多糖以 及某些生物聚合物材料）上C3的沉积和活化而被激活。补体途径的激活产生补体蛋白质 的生物活性片段，例如C3a、C4a和C5a过敏毒素以及C5b-9膜攻击复合物（MAC)，它们介导 炎症活动，包括白细胞趋化反应，巨噬细胞、嗜中性粒细胞、血小板、肥大细胞和内皮细胞的 活化，血管通透性，细胞溶解以及组织损伤。
[0005]D因子为旁路补体途径激活必不可缺的高特异性丝氨酸蛋白酶。其裂解结合C3b 的B因子，产生C3b/Bb酶，其为旁路途径C3/C5蛋白转化酶的活性组分。D因子可能是 用于抑制的合适靶，因为在人中其血浆浓度非常低（I. 8yg/ml)，并且已经证明其为旁路 补体途径激活的限速酶（P.H.Lesavre和H.J.Muller-Eberhard.J.Exp.Med.，1978 ; 148 : 1498-1510J.E.Volanakis等，NewEng.J.Med.，1985 ;312 :395-401) 〇
[0006] 在动物模型和体外研究中已经显示，下调补体活性对治疗一些疾病 指征有效，例如系统性红斑狼疮和肾小球肾炎（Y.Wang等，Proc.Natl.Acad. Sci. ; 1996,93:8563-8568)、风湿性关节炎（Y.Wang等，Proc.Natl.Acad.Sci.; 1995, 92:8955-8959)、心肺体外循环和血液透析（C.S.Rinder,J.Clin.Invest.，1995 ; 96:1564-1572)、器官移植中的超急性排斥（T.J.Kroshus等，Transplantation, 1995 ; 60:1194-1202)、心肌梗死（J.W.Homeister等，J.Immunol. ,1993;150:1055-1064; H.F.Weisman等，Science, 1990 ;249:146-151)、再灌注损伤（E.A.Amsterdam等，Am. J.Physiol.，1995 ;268:H448-H457)、以及成人呼吸窘迫综合征（R.Rabinovici等，了. Immunol.，1992 ; 149:1744-1750)。此外，其他炎性病症和自身免疫/免疫复合物疾病也 与补体激活紧密相关（V.M.Holers，ibid.，B.P.Morgan.Eur.J.Clin.Invest.，1994 :24 : 219-228)，包括烫伤、严重哮喘、过敏性休克、肠炎、荨麻疹、血管性水肿、脉管炎、多发性硬 化、重症肌无力、膜增殖性肾小球肾炎和干燥综合症（Sjogren's综合症）。
[0007] 在补体-介导的病症领域需要抗体疗法，而本发明人源化的抗体提供了有效满足 该需求的高亲和力抗体。
[0008] 发明概述
[0009] -般地，本发明涉及包含小鼠抗体166-32的重链和轻链可变区序列的抗体，小鼠 抗体166-32是能够抑制与D因子有关的生物活性的抗体。例如，在18yg/ml浓度时（相 当于血液中人D因子摩尔浓度的约1.5倍；抗-D因子抗体与D因子的摩尔比约1.5 :1)，可 以观察到该抗体显著抑制旁路补体的活性（参见，例如美国专利号6, 956, 107)。
[0010] 本发明还涉及小鼠Mab166-32的人源化抗体。本发明包括这些抗体的可变重链 和轻链的氨基酸序列以及其相应的核酸序列。本发明的另一个实施方案包括这些抗体的 ⑶R序列。
[0011] 本发明的另一个实施方案包括包含本发明抗体的组合物。在另一个实施方案中， 本发明提供了含有本发明抗体序列的细胞系和载体。在一个方面，本发明包括制备和使用 本发明抗体和组合物的方法。
[0012] 本发明的另一个实施方案是这些人源化抗体在制备治疗与过度或不受控制的补 体激活有关的病症的药物或组合物中的应用。所述病症包括心肺体外循环期间的补体 激活，由急性心肌梗塞、动脉瘤、中风、出血性休克、挤压伤、多器官衰竭、低血容量性休克 (hypobolemicshock)、肠局部缺血或引起局部缺血的其他事件后的缺血-再灌注而引起的 补体激活。还显示补体激活与炎性病症有关，如严重烧伤、内毒素血症、脓毒性休克、成人呼 吸窘迫综合征、血液透析、过敏性休克、严重哮喘、血管性水肿、克罗恩氏病、镰刀形红细胞 贫血病、链球菌感染后肾小球肾炎和胰腺炎。病症可以是不良药物反应、药物过敏、IL-2诱 导的血管渗漏综合症或放射摄影造影剂过敏的结果。它还包括自身免疫性疾病如系统性红 斑狼疮、重症肌无力、类风湿性关节炎、阿尔茨海默氏病和多发性硬化。补体激活还与移植 排斥有关。此外，补体激活与眼病如年龄-相关的黄斑变性、糖尿病性视网膜病有关。
[0013] 附图简述
[0014] 图IA和IB描述了小鼠MAb166-32可变重链（图1A)和可变轻链（图1B)的氨 基酸序列。
[0015] 图2A和2B描述了小鼠MAb166-32可变重链（图2A)和可变轻链（图2B)的核 酸序列。
[0016] 图3描述了小鼠MAb166-32重链的比对。
[0017] 图4描述了小鼠MAb166-32轻链的比对。
[0018] 图5描述了每一个人源化抗体克隆#56、#111、#250和#416的可变重链和可变轻 链的氨基酸序列。
[0019] 图6描述了人源化抗体Fab克隆#56、#111、#250和#416的溶血实验结果。
[0020] 图7描述了人源化抗体Fab克隆#56、#111、#250和#416对旁路补体激活的抑制。
[0021 ] 图8A-B(可变重链（VH)共有框架）和图9A-B(可变轻链（VL)共有框架）描述了 示例性的受者人共有框架序列，其可用于实施本发明并具有如下序列标识符：（图8A-B)人VH亚组I共有框架减去KabatCDR(SEQIDNO:28)、人VH亚组I共有框架减去延伸的高变 区（SEQIDNO:29-31)、人VH亚组II共有框架减去KabatCDR(SEQIDNO:32)、人VH亚 组II共有框架减去延伸的高变区（SEQIDNO:33-35)、人VH亚组III共有框架减去Kabat CDR(SEQIDNO: 36)、人VH亚组III共有框架减去延伸的高变区（SEQIDNO: 37-39)、人VH 亚组VII共有框架减去KabatCDR(SEQIDNO:55)、人VH亚组VII共有框架减去延伸的高 变区（SEQIDNO:56-58)、人VH受体框架减去KabatCDR(SEQIDNO:40)、人VH受体框架 减去延伸的高变区（SEQIDNO:41-42)、人VH受体2框架减去KabatCDR(SEQIDNO:43) 和人VH受体2框架减去延伸的高变区（SEQIDNO:44-46)以及（图9A-B)人VLK亚组I共有框架（3￡〇10勵：47)、人￥1^亚组11共有框架（3￡〇10勵：48)、人1〇亚组111共有 框架（SEQIDNO:49)和人K亚组IV共有框架（SEQIDNO:50)。
[0022] 发明详述
[0023] 定义
[0024] 本文全篇中所用的术语应解释为具有对本领域普通技术人员而言常规和典型的 意义。然而，申请人希望给予下列术语如下特定定义。
[0025] 短语"基本一致"相对于抗体链多肽序列而言可以被解释为抗体链与参考多肽序 列有至少约70%、80%、90%或95%的序列一致性。对于核酸序列，该术语可以被解释为核 苷酸序列与参考核酸序列有至少约85%、90%、95%或97%的序列一致性。
[0026] 术语"一致性"或"同源性"应解释成是指，在比对序列并引入空隙（如果需要，以 使整个序列达到最大的序列一致性百分比）之后，并且不考虑保守替代作为序列一致性的 一部分时，候选序列中和与其比较的对应序列中的残基相同的氨基酸残基的百分数。N端或 C端延伸或插入不应被理解成是减少了一致性或同源性。用于比对的方法和计算机程序是 本领域所熟知的。用序列分析软件可以测定序列一致性。
[0027] 术语"抗体"以其最广的意义使用，并且特定地包括：单克隆抗体（包括全长的 单克隆抗体）、多克隆抗体和多特异性抗体（例如双特异性抗体）。抗体（Ab)和免疫球蛋 白（Ig)是具有相同结构特征的糖蛋白。抗体对特定靶表现出结合特异性，而免疫球蛋白 则包括抗体以及缺乏靶特异性的其它抗体样分子。天然抗体和天然免疫球蛋白通常是约 150, 000道尔顿的异四聚体糖蛋白，其由两个相同的轻链（L)和两个相同的重链（H)组成。 每条重链的一端有可变区（VH)，其后是多个恒定区。每条轻链的一端有可变区（VL)，另一 端是恒定区。
[0028] 此处所用的"抗-人D因子抗体"指以抑制或基本上降低补体激活的方式特异性 结合人D因子的抗体。
[0029] 在抗体可变区语境中所用的术语"可变"指：在抗体之间可变区的某些部分在序列 上有很大的不同，并且这些部分在每个特定抗体对其特定靶的结合和特异性中有作用。然 而，可变性并非均匀地分布在抗体可变区中。它集中在轻链和重链可变区中称为互补决定 区（CDR)(也称为高变区（HVR))的三个节段中。可变区中更高度共有的部分称为框架（FR)。 天然重链和轻链的可变区各包含四个FR区，它们大多数采取折叠构型，由三个CDR连 接，该三个⑶R连接形成环连接且在某些情况下形成P折叠的一部分。每条链中的多个CRD 通过FR区连接在相邻近的位置，并且和另一条链的CDR-起形成抗体的靶结合部位（参见 Kabat等）。除非另外指明，如此处所用的，免疫球蛋白氨基酸残基的编号是根据Kabat等 (SequencesofProteinsofImmunologicalInterest，NationalInstituteofHealth, Bethesda，Md. 1987)的免疫球蛋白氨基酸残基编号系统来进行的。
[0030] 术语"高变区"、"HVR"或"HV"在此使用时指其序列高度可变的和/或形成结构限 定环的抗体可变区的区域。通常，抗体包括6个高变区：3个在VH中〇11、112、113)，3个在￥1 中（L1、L2、L3)。本发明使用并包括许多高变区描述。Kabat互补决定区（⑶R)是基于序列 可变性的且最常用（Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第 五版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,MD. (1991)) 〇 而Chothia指结构环的位置（Chothia和LeskJ.Mol.Biol. 196 :901-917 (1987))。AbM高 变区代表KabatQ)R和Chothia结构环之间的折衷，并且为OxfordMolecyIar的AbM抗 体模型软件所使用。"接触"高变区是基于可获得的复合晶体结构分析。来自每个这些高变 区的残基记录如下。
[0031]
[0032]Kabat编号
[0033]HlH31-H35H26-H35H26-H32H30-H35
[0034]Chothia编号
[0035]
[0036] 高变区可包括如下"延伸的高变区" ：VL中的24-36或24-34 (LI)、46-56或 5〇-56(12)和89-97(1^3)以及￥11中的 26-35〇11)、5〇-65或49-65〇12)和93-102、94-102 或 95-102 (H3)。每个这些定义的可变区残基根据上文的Kabat进行编号。
[0037] "框架"或"FR"残基为此处定义的除高变区残基或CDR残基以外的可变区残基。
[0038] 术语"如Kabat编号的可变区残基"或"如Kabat编号的氨基酸位点"及其变体，指 Kabat等，SequencesofProteinsofImmunologicalInterest,第五版，PublicHealth Service,NationalInstitutesofHealth,Bethesda，MD. (1991)中用于抗体编译的重链 可变区或轻链可变区的编号系统。利用该编号系统，事实上线性的氨基酸序列相应于对可 变区FR或CDR的截短或插入可包含更少的或额外的氨基酸。例如，重链可变区可包括H2 的残基52后的单个氨基酸插入（根据Kabat为残基52a)以及重链FR残基82后插入的残 基（例如根据Kabat为残基82a、82b和82c等等）。对于给定的抗体，可通过将该抗体序列 的同源区域与"标准的"Kabat编号序列进行比对来确定其Kabat残基编号。
[0039]Kabat编号系统通常在提及可变区中的残基（大约轻链的残基1-107以及重链 的残基 1_113)时使用（例如，Kabat等，SequencesofImmunologicalInterest,第五 版，PublicHealthService,NationalInstitutesofHealth,Bethesda,Md. (1991))〇 "EU编号系统"或"EU索引"通常在提及免疫球蛋白重链恒定区中的残基时使用（例如， 上文Kabat等中报道的EU索引；重链恒定区中的铰链区大约为重链的残基216-230 (EU编 号））。"如Kabat中的EU索引"指人IgGlEU抗体的残基编号。除非此处另有说明，抗体可 变区中的残基编号的参照物指通过Kabat编号系统编号的残基。除非此处另有说明，抗体 恒定区中的残基编号的参照物指通过EU编号系统编号的残基（例如，参见美国临时申请号 60/640, 323,EU编号的图）。
[0040] 术语"抗体片段"指全长抗体的一部分，通常是靶结合区或可变区。抗体片段的例 子包括？ &13、？&13'、？(&13'）2和？7片段。短语抗体的"功能性片段或类似物"为具有与全长 抗体相同的定性生物学活性的化合物。例如，抗-人D因子抗体的功能性片段或类似物为 可以以阻止或基本上降低补体激活的方式结合D因子的一种化合物。如此处所用的，对于 抗体"功能性片段"是指Fv、F(ab)和F(ab'）2片段。"Fv"片段是含有全部靶识别和结合位 点的最小抗体片段。该区域由紧密、非共价关联的一个重链可变区和一个轻链可变区的二 聚物（VH_\二聚物）组成。在该构型中，各可变区中的三个CDR相互作用，从而形成VH-\ 二聚物表面上的靶结合位点。6个CDR共同