Enz.，58 :44 (1979)，Barnes等，Anal.Biochem.，102 :255 (1980)，美国专利No. 4, 767, 704 ; 4,657,866 ;4, 560, 655 ;5, 122,469 ;5, 712, 163 或 6, 048, 728 中所述的任一培养基可用作 (本发明）宿主细胞的培养基。所有这些培养基中可以按需添加入激素和/或其它生长因 子（如胰岛素、转铁蛋白或表皮生长因子）、盐（如X氯化物，其中X是钠、妈、镁；和磷酸 盐）、缓冲剂（如ffiPES)、核苷酸（如腺苷和胸苷）、抗生素（如GENTAMYCIN?药）、微量元 素（定义为最终浓度通常在微摩尔范围内的无机化合物）以及葡萄糖或等价能源。另外也 可加入合适浓度的本领域技术人员已知的其它必需补充物。培养条件，如温度、PH等，与前 述选择宿主细胞表达时所用条件一样，这对本领域普通技术人员来说是显而易见的。
[0125] 抗体纯化
[0126]当采用重组技术时，抗体可产生在细胞内（周质空间内）或被直接分泌到培养基 中。如果抗体突变体产生在细胞内，则第一步是除去宿主细胞或裂解片段的颗粒碎片，例 如通过离心或超离心除去。Carter等，Bio/Technology10:163-167(1992)描述了分泌入 大肠杆菌周质空间的抗体的分离过程。简言之，在乙酸钠（PH3. 5)、EDTA和苯甲基磺酰氟 (PMSF)存在下融解细胞浆状物约30分钟。离心除去细胞碎片。若抗体突变体被分泌到培 养基中，贝1J通常首先用商业上购得的蛋白浓缩滤膜（例如Amicon或MilliporePellicon 超滤装置）浓缩该表达系统的上清液。在前述任何步骤中均可加入抑制蛋白水解的蛋白酶 抑制剂（如PMSF)，还可加入抗生素来防止外来污染物的生长。
[0127] 例如，可用羟基磷灰石层析、凝胶电泳、透析和亲和层析来纯化从细胞中制得的抗 体组合物，其中亲和层析是优选的纯化方法。蛋白A作为亲和配体的合适性取决于抗体突 变体中免疫球蛋白Fc区的种类和同种型。蛋白A可用来纯化以人IgGU IgG2或IgG4重链 为基础的抗体（Lindmark等，J.Immunol.Meth.62:1-13(1983))。对于所有小鼠同种型和 人IgG3,建议采用蛋白G (Guss等，EMBOJ.5 :1567-1575(1986))。亲和配体附着的基质通 常是琼脂糖，但是也可采用其它基质。机械上稳定的基质，如控制孔径的玻璃或聚（苯乙烯 二乙烯基）苯能达到比琼脂糖更快的流速，并使操作时间缩短。当抗体突变体包含CH3区 时，可用BakerbondABXTM树脂（J.T.Baker，Phillipsburg，NJ)来纯化。根据待回收的抗 体突变体，还可采用其它蛋白纯化方法，如在离子交换柱上分级分离、乙醇沉淀、反向HPLC、 硅胶层析、肝素SEPHAROSE?层析、阴离子或阳离子交换树脂（如聚天冬氨酸柱）层析、聚焦 层析、SDS-PAGE和硫酸铵沉淀。
[0128] 在初步纯化后，可对包含目的抗体突变体和污染物的混合物进行低pH疏水作用 层析，采用pH约2. 5-4. 5的洗脱缓冲液，最好是在低盐浓度（如约0-0. 25M盐浓度）下进 行。
[0129] 药物制剂
[0130] 将具有所需纯度的多肽与本领域中通常采用的任选的"药学上可接受"载体、赋形 剂或稳定剂（所有这些均称为"赋形剂"）例如缓冲剂、稳定剂、防腐剂、等渗剂、非离子性洗 涤剂、抗氧化剂和其它各种添加剂）（参见Remington'sPharmaceuticalSciences，16版， Osol，A.编辑（1980)混合，制成多肽或抗体的药物制剂，以用于作为冻干制剂或水性溶液 保藏。这些添加剂必须在所采用的剂量和浓度下对接受者没有毒性。
[0131] 缓冲剂有助于将pH维持在大致为生理条件的范围内。缓冲剂的浓度最好在大约 2mM至50mM内。适用于本发明的缓冲剂包括有机和无机酸及其盐，例如柠檬酸盐缓冲液（例 如柠檬酸单钠-柠檬酸二钠混合物、柠檬酸-柠檬酸三钠混合物、柠檬酸-柠檬酸单钠混合 物等）、琥珀酸盐缓冲液（例如琥珀酸-琥珀酸单钠混合物、琥珀酸-氢氧化钠混合物、琥珀 酸-琥珀酸二钠混合物等）、酒石酸盐缓冲液（例如酒石酸-酒石酸钠混合物、酒石酸-酒 石酸钾混合物、酒石酸-氢氧化钠混合物等）、延胡索酸盐缓冲液（例如延胡索酸-延胡 索酸单钠混合物）、延胡索酸盐缓冲液（例如延胡索酸-延胡索酸钠混合物、延胡索酸-延 胡索酸二钠混合物、延胡索酸单钠-延胡索酸二钠混合物等）、葡糖酸盐缓冲液（例如葡糖 酸-葡糖酸钠混合物、葡糖酸-氢氧化钠混合物、葡糖酸-葡糖酸钾混合物等）、草酸盐缓冲 液（例如草酸-草酸钠混合物、草酸-氢氧化钠混合物、草酸-草酸钾混合物等）、乳酸盐缓 冲液（例如乳酸-乳酸钠混合物、乳酸-氢氧化钠混合物、乳酸-乳酸钾混合物等）、以及乙 酸盐缓冲液（例如乙酸-乙酸钠混合物、乙酸-氢氧化钠混合物等）。另外，也可以是磷酸 盐缓冲液、组氨酸缓冲液和三甲胺如（Tris)。
[0132] 加入防腐剂以阻止微生物生长，加入量在0. 2-1% (w/v)范围内。用于本发明的合 适的防腐剂包括苯酚、苄醇、间甲酚、对羟苯甲酸甲酯、对羟苯甲酸丙酯、十八烷基二甲基苯 基氯化铵、苯扎卤（例如氯、溴、碘）铵、氯化己烷双胺、对羟苯甲酸烷酯（如对羟苯甲酸甲 酯或对羟苯甲酸丙酯）、邻苯二酚、间苯二酚、环己醇和3-戊醇。
[0133] 等渗剂有时称为"稳定剂"，可以添加以确保本发明的液体组合物的等渗性，其包 括多羟基糖醇，优选三羟或更多羟基的糖醇，例如甘油、丁四醇、阿糖醇、木糖醇、山梨糖醇 和甘露糖醇。
[0134] 稳定剂指广义的赋形剂，其功能从填充剂到溶解治疗剂或有助于防止变性或粘附 在容器壁上的添加剂。典型的稳定剂可以是多羟基糖醇（如上所述）；氨基酸，如精氨酸、 赖氨酸、甘氨酸、谷氨酰胺、天冬酰胺、组氨酸、丙氨酸、鸟氨酸、L-亮氨酸、2-苯基丙氨酸、 谷氨酸、苏氨酸等；有机糖或糖醇，如乳糖、海藻糖、木苏糖、甘露糖、山梨糖醇、木糖醇、核糖 醇、肌醇、半乳糖醇、甘油等，包括环多醇如环己六醇；聚乙二醇；氨基酸聚合物；含硫还原 剂，如尿素、谷胱苷肽、硫辛酸、巯基乙酸钠、硫代甘油、a-单硫代甘油和硫代硫酸钠；低分 子量多肽（即小于10个残基）；蛋白质，如人血清白蛋白、牛血清白蛋白、明胶或免疫球蛋 白；亲水性聚合物，如聚乙烯吡咯烷酮单糖（单糖是例如木糖、甘露糖、果糖、葡萄糖）；二糖 如乳糖、麦芽糖、蔗糖和三糖如蜜三糖；多糖如葡聚糖。稳定剂的含量范围为每份重量活性 蛋白中有0. 1-10, 〇〇〇重量份。
[0135] 添加非离子表面活性剂或洗涤剂（也称为"润湿剂"）有助于溶解治疗剂以及保护 治疗剂避免受搅动引起的凝集，它还使得当制剂暴露于遭受应力的剪切表面时不会引起蛋 白变性。合适的非离子表面活性剂包括聚山梨醇酯（20、80等）、polyoxamer(184,188等）、 Pluronic.RTM.多元醇、聚氧乙烯山梨糖醇单醚（吐温.RTM. -20、吐温.RTM. -80等）。非离 子性表面活性剂的含量约为0. 05mg/ml至I.Omg/ml，较佳的约0. 07mg/ml至约0. 2mg/ml。
[0136] 其它各种赋形剂包括填充剂（如淀粉）、螯合剂（如EDTA)、抗氧化剂（如抗坏血 酸、甲硫氨酸、维生素E)和共溶剂。本发明的制剂还含有待治疗特定适应症所需的多种活 性化合物，优选相互间没有不利影响的有互补活性的那些化合物。例如，理想地还可以提供 免疫抑制剂。这些分子适于以组合形式存在，其量对期望的目的有效。在胶态药物递送系 统（例如，脂质体、白蛋白微珠、微乳剂、纳颗粒和纳胶囊）或巨乳剂中，活性组分还可被包 裹在例如通过团聚技术或界面聚合制得的微胶囊（例如羟甲基纤维素或明胶微囊和聚（甲 基丙稀酸甲酯）微囊）中。这些技术公开在Remington'sPharmaceuticalSciences, 16 版（1980)，A.Osal编辑。
[0137] 用于体内给药的制剂必须无菌。这很容易例如通过无菌滤膜过滤来实现。可以 制得缓释制剂。缓释制剂的合适例子包括含有抗体突变体的固体疏水聚合物半渗透基质， 其中所述基质是成形制品，如薄膜或微胶囊。缓释基质的例子包括聚酯、水凝胶（例如，聚 (甲基丙烯酸2-羟基乙酯）或聚（乙烯醇））、聚交酯（美国专利号3, 773, 919)、L-谷氨 酸和L-谷氨酸乙酯的共聚物、不能降解的乙烯乙酸乙烯酯、可降解的乳酸-羟基乙酸共聚 物如LUPRONDEPOT?(由乳酸-羟基乙酸共聚物和乙酸亮丙瑞林组成的可注射的微珠）、和 聚-D-(-)-3-羟基丁酸。尽管聚合物例如乙烯乙酸乙烯酯和乳酸-羟基乙酸能够在100天 内持续释放分子，但是某些水凝胶释放蛋白的时间却较短。当包裹在胶囊内的抗体长时间 停留在体内时，它们会由于暴露在37°C潮湿环境下而变性或凝聚，从而导致生物活性丧失， 且免疫原性可能会改变。可以根据涉及的机理来设计合理策略加以稳定。例如，如果发现 凝聚的机理是通过硫代-二硫键互换而形成了分子间S-S键，则可通过修饰巯基残基、从酸 性溶液中冻干、控制含水量、采用合适的添加剂和开发特定的聚合物基质组合物来达到稳 定化。
[0138] 在治疗特定疾病或状况中，治疗性多肽、抗体或其片段的有效量将取决于疾病或 状况的性质，并且能用标准临床技术来确定。在可能的时候，希望首先在体外测定本发明药 物组合物的剂量-反应曲线，然后在人体内测试前在有用的动物模型系统中测定。
[0139] 在一优选的实施方案中，通过皮下注射给予治疗性多肽、抗体或其片段的水溶液。 每剂的范围在大约0. 5yg至50yg/千克体重，或更优选从3yg至约30yg/千克体重。
[0140] 皮下给药的剂量方案可以从一月一次到每日一次，这取决于许多临床因素，包括 疾病类型、疾病严重程度以及患者对治疗剂的敏感程度。
[0141] 人源化抗体的应用
[0142] 本发明的人源化抗体可用于诊断实验，例如检测特定细胞、组织或血清中感兴趣 靶的表达。对于诊断性应用，抗体突变体通常用可检测基团作标记。可采用许多标记物。 定量测定荧光变化的技术如上所述。化学发光底物通过化学反应被电激发，然后可发出可 测定（例如通过化学发光计）的光或提供能量给荧光接受器。酶标记物的例子包括萤光素 酶（如萤火虫萤光素酶和细菌萤光素酶；美国专利号4, 737, 456)、荧光素、2, 3-二氢酞嗪二 酮、苹果酸脱氢酶、脲酶、过氧化物酶（如辣根过氧化物酶（HRPO))、碱性磷酸酶、P-半乳 糖苷酶、葡糖淀粉酶、溶菌酶、糖氧化酶（例如，葡糖氧化酶、半乳糖氧化酶和葡萄糖-6-磷 酸脱氢酶）、杂环氧化酶（如尿酸酶和黄嘌呤氧化酶）、乳过氧化物酶、微过氧化物酶等。 O'SyIlivan等，MethodforthePreparationofEnzyme-AntibodyConjugatesforuse inEnzymeImmunoassay,MethodsinEnzym. (Ed.J.Langone&H.VanVunakis)，Academic press，NewYork，73 :147-166(1981)中将描述了将酶偶联于抗体的技术。
[0143] 有时，标记可以与抗体变体间接偶联。本领域技术人员应该知道实现这一目的的 各种方法。例如，抗体变体可以与生物素偶联，而上述三大类标记物则与亲和素偶联，或两 者互换。生物素选择性地结合亲和素，从而通过这一间接方式将标记物和抗体变体偶联起 来。或者，为了间接地偶联标记物和抗体变体，可使抗体变体与小的半抗原（如洋地黄毒苷 (digloxin))偶联，而上述不同类型的标记物中的一种则与抗该半抗原的抗体变体（如抗 洋地黄毒苷抗体）偶联。这样，就间接地将标记物和抗体变体偶联起来。
[0144] 在本发明的另一个实施方案中，不标记抗体变体，该抗体变体的存在可用与之结 合的标记的抗体来检测。
[0145] 本发明的抗体可用于任何已知的实验方法，如竞争性结合实验，直接和间接夹心 实验和免疫沉淀实验。Zola，MonoclonalAntibodies:AManualofTechniques)，147-158 页（CRCPress，Inc. 1987)。
[0146] 竞争性结合实验依赖于标记的标准品与测试样品竞争结合有限量抗体变体的能 力。测试样品中靶的量与结合抗体的标准品的量成反比。为了便于确定已结合的标准品的 量，抗体通常在竞争前后为不溶性的。这样就能方便地将已结合抗体的标准品和测试样品 从仍未结合的标准品和测试样品中分离出来。
[0147] 夹心实验包括采用两种抗体，每种抗体能结合待检测蛋白的不同的免疫原性部 分或表位。在夹心测定法中，待分析的测试样品与固定在固相载体上的第一抗体结合，然 后，第二抗体与测试样品结合，从而形成了不溶性的三组分复合物。例如见美国专利号 4, 376, 110。第二抗体本身可用可检测物质标记（直接夹心测定法），或可利用标记了可检 测物质的抗免疫球蛋白抗体来测定（间接夹心测定法）。例如，一类夹心测定法是ELISA测 定法，在该种情况下，可检测物是酶。
[0148] 对于免疫组织化学，肿瘤样品可以是新鲜的或冷冻的，或可包埋在石蜡中并用防 腐剂（例如福尔马林）来固定。
[0149] 抗体也可用于体内诊断实验。通常，抗体用放射性核素（如.8即.111111、. sup. 99Tc、.sup. 14C、.sup. 1311、.sup. 3H、.sup. 32P或?sup. 35S)标记，这样通过免疫闪烁 显影可确定肿瘤的位置。例如，本发明的高亲和力抗-IgE抗体可用于检测存在于例如哮喘 患者肺中IgE的量。
[0150] 本发明的多肽或抗体可以试剂盒形式提供，S卩，将预定剂量的试剂与进行诊断实 验的说明书组合包装。当抗体变体用酶标记时，试剂盒将包括酶所需的底物和辅因子（如 提供可检测的发色团或荧光团的底物前体）。另外，还可包括其它添加剂，如稳定剂、缓冲 液（如封闭缓冲液或裂解缓冲液）等。各种试剂的相对量可以变化很大，使得提供的溶液 中试剂浓度能使实验的灵敏度基本上达到最优。特别是，试剂可以干粉形式（通常是冻干 的）提供，包括在溶解时能提供浓度合适的试剂溶液的赋形剂。
[0151] 抗体的体内应用
[0152] 预期本发明的多肽或抗体可用来治疗哺乳动物。例如在一个实施方案中，将抗体 给予非人哺乳动物以获得临床前数据。示例性的待治疗非人哺乳动物包括非人的灵长类、 狗、猫、啮齿类动物和其它能进行临床前研究的哺乳动物。所述哺乳动物可以是已经建立的 待用抗体来治疗的疾病动物模型，或者可用来研究目的抗体毒性的动物模型。在每个实施 方案中，可在哺乳动物中进行剂量逐步增加的研究。
[0153] 抗体或多肽可通过任何合适的方法施用，包括肠胃外、皮下、腹膜内、肺内、和鼻内 给药，如果需要局部免疫抑制治疗，可以在病变区内施用。胃肠外输注包括肌内、静脉内、动 脉内、腹膜内、或皮下施用。另外，抗体突变体可通过脉冲注入的方式施用，特别是伴随减少 抗体突变体的剂量。优选通过注射施用药物剂量，最优选是静脉内或皮下注射施用，这部分 地取决于是瞬时施用还是不断地施用。
[0154] 为了预防或治疗疾病，抗体或多肽的合适剂量取决于待治疗疾病的类型、疾病的 严重程度和病程、给予抗体突变体是出于预防目的还是治疗目的、以往的治疗、患者的临床 病史以及对抗体的反应、和