的水提液，减压浓缩至小体积（至100ml)， 离心取上清液。在搅拌下加入95%乙醇至含醇量为80%，4°C冷藏静置12h，虹吸上清液弃 去，于3000r/min离心15min，将沉淀抽滤，分别依次用无水乙醇、乙醚洗涤2次，60°C真空干 燥至恒重，即得龙葵粗多糖11. 90g。
[0036] (2)龙葵精制多糖的纯化
[0037] 龙葵粗多糖用蒸馏水溶解配成质量浓度为1%的样品液，缓缓加入5%三氯乙酸 调节pH至2. 5,振荡处理20min，4°C静置4h，以3000r/min离心10min，去除胶状蛋白沉淀。 将上清液加入待处理液量的0. 7%用量的活性炭，以稀HC1调节pH至5,在40°C条件下保温 脱色20min，静置lh后以4000rpm/min离心20min，除去活性炭沉淀。将上清液，加入4倍 量的95%乙醇沉淀，2-6°C静置冷藏24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚 依次洗涤2-3次后，60°C真空干燥得龙葵精制多糖。经测定蛋白质脱除率为88. 98%，多糖 保留率为88. 28%，精制多糖得率为2. 400%。
[0038] 实施例3龙葵精制多糖的抗肿瘤作用
[0039] (1)龙葵精制多糖的体外抗肿瘤作用
[0040] 将从实施例1中制备得到的龙葵精制多糖配制成10mg/mL的储备液，0. 22 y m无菌 滤膜过滤除菌后置于4°C冷藏备用。临用前用无菌注射用水稀释成0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、 1. 2、1. 4、1. 6、1. 8、2. Omg/ml系列浓度。
[0041] 取腹腔内传代7天的肝癌H22小鼠，颈脱臼处死小鼠，无菌操作抽取腹水，置于离 心管，1000r/min离心5min，小心吸取沉淀中的上层细胞，加PBS吹打洗涤2次，1000r/min 离心5min。用含10%小牛血清的RPMI1640的完全培养液吹打，稀释调整肿瘤细胞浓度至 lX105/ml〇
[0042] 将稀释后的瘤液接种于96孔培养板，每组设6复孔，每孔加细胞悬液 100ii1 (1X104个细胞）。实验设置阳性组、阴性组、空白组、给药组，分别加入100ii15-FU 溶液（5mg/ml)、细胞培养液、空白培养液、龙葵精制多糖（0. 2、0. 4、0. 6、0. 8、1. 0、1. 2、1. 4、 1. 6、1. 8、2.Omg/ml)，各孔内液体总量均为200y1。置于37°C、5%C02条件下培养24h及 48h〇
[0043] 培养时间到后，在避光条件下每孔加入5mg/mL的MTT磷酸盐缓冲液20y1，吹打均 匀，继续培养4h。终止培养，用枪头轻轻吸弃150y1培养孔内的培养液，每孔加入150y1 二甲基亚砜，经震荡混匀lOmin，使形成的蓝紫色甲臜颗粒充分溶解。
[0044] 用酶标仪于490nm波长处，测定各孔的吸光度A值，计算细胞抑制率。细胞抑制 率％ =(阴性组A值一实验组A值）/阴性组A值X 100%
[0045] 重复三次实验，结果显示：在体外培养条件下，龙葵精制多糖能明显抑制H22细胞 的增殖，且作用随药物浓度的增加和作用时间的延长而增加。药物在较低浓度即有抑制作 用，作用最佳浓度为1. 4-1. 8mg/mL，抑制率35. 80-85. 4%。龙葵精制多糖对H22细胞的增 殖抑制情况见表1。
[0046] 表1龙葵精制多糖对H22细胞的抑制率
[0047]
[0048] (2)龙葵精制多糖的体内抗肿瘤作用
[0049] 药液的配制：分别称取一定量龙葵精制多糖，加蒸馏水40mL溶解，超声振荡 20min，转移至50mL容量瓶定容，得2mg/mL，4mg/mL，8mg/mL龙葵精制多糖溶液。
[0050] 取传代接种后7-9天之H22肝癌荷瘤小鼠，于无菌条件下从腹腔抽出瘤液，用灭菌 生理盐水（1:4)稀释，调整瘤细胞数至1.37X107/mL，每只小鼠右腋皮下接种0.2mL。随后 将小鼠随机分为5组，每组10只。
[0051] 于接种次日给药，低、中、高剂量药物组分别给予2、4、8mg/ml浓度的龙葵精制多 糖溶液，阳性对照组给予环磷酰胺2mg/ml，阴性对照组给予生理盐水，给药量均为0. 2ml/ 只，每日给药1次，连续8-10天。常规饲养，饮水食物不限，每日观察小鼠的自主活动、大便 和毛色及瘤体大小等情况。
[0052] 停药次日断椎处死，称小鼠体重，解剖剥离皮下瘤体，观察瘤体形态及出血坏死情 况，称瘤重，同时剖取胸腺和脾脏，称其重量，按下式计算抑瘤率及免疫器官指数。抑瘤率 (% )=(对照组平均瘤重-给药组平均瘤重）/对照组平均瘤重X100%。脾脏（胸腺） 指数=脾脏（胸腺）重量（mg) /体重（g)。
[0053] 表2龙葵精制多糖对H22荷瘤小鼠的抗肿瘤作用（^± s)
[0054]
[0055] 注：vs阴性对照组，林P<0? 01
[0056] 表3龙葵精制多糖对H22荷瘤小鼠的免疫器官的作用G± s)
[0057]
[0058] 注：vs阳性对照组，*P< 0? 05,**P< 0? 01
[0059] 结果显示：
[0060] 龙葵多糖对H22荷瘤小鼠的生长有明显的抑制作用，且存在剂量效应关系，见图 1。实验组在给药剂量30、60、120mg/kg时，平均抑瘤率分别为37. 73%、38. 24%、42. 60%， 见表2。龙葵多糖能提高H22荷瘤小鼠的脾脏指数和胸腺指数，相比于阳性环磷酰胺组明显 降低脾脏指数和胸腺指数，龙葵多糖对小鼠的毒副作用小，更加安全，见表3。
【主权项】
1. 一种具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化方法，其特征在于包括以下步骤： (1) 龙癸粗多糖样品的制备： 龙葵饮片40-60°C干燥6-8h后，粉碎过40目筛，制得龙葵粉末；将龙葵粉末加入4-5重 量倍石油醚，于50-55°C水浴条件下，加热回流脱脂2次，每次2h，过滤去液留渣；将药渣加 入2倍重量的80%乙醇，于80°C水浴条件下加热回流2次，每次lh，过滤去液留渣，药渣晾 干，制成已脱脂的龙葵粉末；将上述已脱脂的龙葵粉末置于闪式提取仪的容器中，加蒸馏水 30重量倍，以80 V电压闪式提取2次，每次2min ;合并提取液，纱布过滤，以3000 r/min离 心15 min，取上清液减压浓缩至50%药材体积，在搅拌下加入乙醇调节含醇量至80%，2-6°C 静置冷藏12-24h，减压抽滤，沉淀用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3次后，60°C真空干燥，得龙 葵粗多糖； (2) 龙葵精制多糖的纯化： 将步骤（1)所得的龙葵粗多糖用蒸馏水溶解配成质量浓度为1%的溶液，用3%-5%三 氯乙酸溶液缓缓调节pH至2. 5-3. 0,振荡处理20 min，2-6°C静置2-4h，以3000r/min离心 IOmin去除胶状蛋白沉淀；在上清液中加入活性炭，以稀HCl调节pH至5,40°C保温脱色20 min，静置Ih后，以4000 rpm/min离心20min除去沉淀；将上清液加入4倍量的95%乙醇沉 淀，2-6°C静置冷藏12-24h，以4000rpm/min离心收集沉淀，用无水乙醇、乙醚依次洗涤2-3 次后，60 °C真空干燥得龙葵精制多糖。2. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（2)中用三氯乙酸溶液调节 pH 至 2. 5。3. 根据权利要求1所述的提取纯化方法，其特征在于：步骤（2)中活性炭的加入量为待 处理液量的0. 7%。4. 权利要求1制得的具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖在制备抗肿瘤药物中应用。
【专利摘要】本发明公开了一种新的、相对安全、得率高、纯度高、具有抗肿瘤活性的龙葵精制多糖的提取纯化工艺路线，其步骤如下：龙葵粉末粉碎过筛，依次采用石油醚、乙醇脱脂，再用闪式提取，经浓缩醇沉后，以三氯乙酸脱蛋白，活性炭脱色，二次醇沉，最后干燥制得龙葵精制多糖，得率为2.554%。该产物对H22肝癌细胞的体外生长具有抑制作用，1.4-1.8？mg/mL浓度时细胞抑制率35.80-85.4%，对H22荷瘤小鼠的肿瘤生长具有抑制作用，抑制率为37.73%？-42.60%。
【IPC分类】A61P35/00, C08B37/00, A61K31/715
【公开号】CN105111323
【申请号】CN201510534404
【发明人】黄越燕, 朱琦峰
【申请人】嘉兴学院
【公开日】2015年12月2日
【申请日】2015年8月27日