一种多溴联苯同系物半抗原及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及一种半抗原及其制备方法，尤其是涉及一种多溴联苯同系物半抗原及 其制备方法。
【背景技术】
[0002] 溴系阻燃剂是目前世界上产量最大的有机阻燃剂之一，其中主要是多溴联苯醚 (PBDEs)和多溴联苯（PBBs)类物质。其中，四溴双酚A(简称TBBPA)是由双酚A溴化所得， 它是我国目前有机溴系阻燃剂的主要产品，属于多溴联苯类中对人体危害较小的新型溴系 阻燃剂。TBBPA常作为阻燃剂添加入树脂、聚苯乙烯和聚氨酯泡沫等高分子合成材料中，广 泛地应用于塑料制品、纺织品、电路板和建筑装潢材料等各种制造业产品和材料领域，并随 着这些产品的使用，慢慢逸散到环境中。
[0003]国内外广大环境学者对各种环境介质和生物样品中TBBPA的浓度和毒性效应 做了大量研究。研究表明，TBBPA可以在各种水体、底泥、土壤、大气等各种环境介质中存 在，并可以随气溶胶远距离迀移。在不同营养级生物体内含量变化表现出明显的生物富 集性，并对生物体有毒性和内分泌干扰性。TBBPA的污染能力有很高的持久性，主要危害 有三点：首先，长期接触会妨碍大脑和骨骼发育；其次，被焚化处理时，会释放出有高致癌 性的溴化二恶英和呋喃。因此，研究认为TBBPA是潜在的具有持久性、生物累积性和毒性 (PBT-persistentbioaccumulativetoxie)的化合物。早在2003年，TBBPA就已经引起世 界绿色和平组织的重视。欧盟关于环保的"2个指令"起初计划限制所有溴代阻燃剂的使 用，并设想以磷、氮替代，但因氮、磷资源缺乏，个别性能远不能满足需求以及可能造成水体 的富营养化的潜在风险，而未将TBBPA纳入。目前，TBBPA已作为危害物质被列入《东北大 西洋海洋环境保护条例》0SPAR的名录中。
[0004] 目前对TBBPA的检测手段主要为气相色谱和高效液相色谱等仪器检测方法，这些 方法虽然准确可靠，但对样品的预处理方法和操作人员的专业性有很高的要求。正因为这 些方法的处理复杂、耗时、仪器价格昂贵而不适合推广使用，也不利于在环境污染事故现场 快速检测。为克服这些缺点，寻求一种快速、简便、灵敏且经济实用的分析方法就成为环境 监测领域的主要研究方向。
[0005] 20世纪60年代发展起来的免疫分析（Immunoassay,IA)是基于抗原和抗体的特异 性、可逆性结合反应的分析技术。免疫分析具有常规理化分析技术无可比拟的选择性和高 灵敏性，非常适合复杂介质中痕量组分的分析。因此免疫分析具有的特异性强、灵敏度高、 方法快捷简单、分析通量大、检测成本低等优点，使得该类方法可以满足简单、快速、灵敏地 检测持久性有机污染物的要求。1985年美国Cetus公司的K.B.Mullis和R.K.Saiki等发 明了一种特异性DNA体外扩增技术，成为PolymeraseChainReaction，简称PCR，即聚合 酶链式反应。1992年Sano等将免疫分析技术与PCR技术结合，发展出免疫PCR技术。免 疫PCR技术兼具了免疫分析的特异性强和PCR技术的灵敏度高的特点，可用于检测环境中 痕量污染物。随着生物条形码技术的发展，免疫PCR技术与生物条形码相结合发展的免疫 PCR生物条形码方法可以解决步骤繁琐、有机溶剂干扰过多的问题，此外还可以大大提高检 测方法的灵敏度。
[0006] 目前尚没有免疫PCR生物条形码检测方法检测TBBPA的相关报道。对于TBBPA免 疫监测方法的建立，高纯度合适的半抗原是制备具有高灵敏度和特异性免疫原和高效价抗 体的根本，更是建立TBBPA免疫检测方法的关键。因此，TBBPA半抗原的制备是采用免疫方 法测定TBBPA的基础，对于建立多溴联苯单体的监测方法，具有重要的应用价值和理论研 究意义。
【发明内容】
[0007] 针对现有技术中的缺陷，本发明的目的是首次提供一种步骤简单，速度快，产率高 的多溴联苯同系物半抗原及其制备方法。
[0008] 本发明的目的是通过以下技术方案实现的：
[0009] 本发明提供了一种多溴联苯同系物半抗原，结构式如式I所示：
[0010]
式I。
[0011] 所述式I化合物为淡黄色针状结晶体，熔点为167~170°C。
[0012] 本发明还涉及一种多溴联苯同系物半抗原的制备方法，包括步骤：
[0013]TBBPA
t溴乙酸在碱性环境中反应，在TBBPA分子酚羟基基 团末端引入一个羧基基团。引入的羧基基团可与载体蛋白偶联。
[0014] 优选地，所述TBBPA与溴乙酸在碱性环境中反应具体包括：
[0015]A1、将TBBPA和碱金属氢氧化物溶解在非质子性有机溶剂中，得溶液A，逐渐升温；
[0016]A2、将溶解于非质子性有机溶剂的溴乙酸逐滴加入到步骤A1中升温后的溶液A 中，随后保持恒温回流反应，直至原料点消失为止。
[0017] 其化学反应方程式如下：
[0018]
[0019] 优选地，所述非质子性有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或丙酮。
[0020] 优选地，所述的TBBPA、碱金属氢氧化物和溴乙酸的摩尔比为1:2~4:1~2。如 化学反应方程所示，理想状态下TBBPA、碱金属氢氧化物的摩尔比是1:2,但为了反应顺利 进行，一般碱金属氢氧化物可以过量一些，但不能超过2倍；理想状态下TBBPA与碱金属氢 氧化物反应生成的半抗原前体物与溴乙酸的摩尔比是1:1，为确保反应顺利向右进行，溴乙 酸要过量，但不能超过理想摩尔量的2倍。
[0021 ] 优选地，所述碱金属氢氧化物为氢氧化钠或氢氧化钾。
[0022] 优选地，步骤A2中，所述溶液A温度为80~85°C，恒温回流反应时间为4~6小 时。该温度更有利于反应的进行，且用薄层层析检测，4~6小时可反应完全。
[0023] 优选地，还包括以下步骤：
[0024]B、反应结束后用浓盐酸调节pH终止反应；
[0025] C、向反应液中加入乙酸乙酯，分离并用水洗、干燥有机相；
[0026] D、将干燥后的有机相去溶剂，过层析柱分离纯化，最终得到纯化后的淡黄色针状 结晶体TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羟苯基）异丙酯））乙酸，即式I 化合物。TBBPA半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;恪点：167-170°C。
[0027] 优选地，步骤B中，所述pH为2. 0~4. 0。偏酸性的溶液，有利于终止反应，也防止 逆反应的发生。
[0028] 优选地，步骤D中，所述层析柱分离纯化的薄层层析展开剂采用体积比为1:4的丙 酮和正己烷组成的混合溶液。由于半抗原是有机相物质，本发明意外发现采用该展开剂更 利于半抗原的纯化，使获得的半抗原纯度更高。
[0029] 本发明还提供了一种多溴联苯同系物半抗原的用途，用于痕量溴代阻燃剂TBBPA 的检测。
[0030] 优选地，所述痕量溴代阻燃剂TBBPA的检测方法，包括将式I化合物通过碳化二亚 胺法、混合酸酐法或活化酯法与载体蛋白偶联制备TBBPA人工全抗原。
[0031] 优选地，所述TBBPA人工全抗原为TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA
或TBBPA人工包被原TBBPA-OVA
其中，BSA为牛血清蛋白， OVA为卵清白蛋白。
[0032] 本发明涉及一种多溴联苯同系物半抗原及其制备方法，由于TBBPA是小分子物 质，只具有反应原性而没有免疫原性，而且该分子上没有能与蛋白质分子直接结合的氨基、 羧基等官能团，因此需要对TBBPA分子衍生化使其分子上带上一个两个碳链长的羧基。为 了免疫分析方法的实现，用碳化二亚胺法或活化酯法或混合酸酐法将这个含羧基的半抗原 与蛋白质分子偶联制备人工全抗原（包括人工免疫原和人工包被原），其中人工免疫原免 疫新西兰大白兔，通过生物体内的免疫应答进而制备得到抗TBBPA的特异性抗体，而人工 包被原和TBBPA都能与抗TBBPA特异性抗体免疫球蛋白IgG发生特异性识别的反应，即人 工包被原和TBBPA是直接竞争的关系，从而建立免疫分析方法用于水体、土壤、大气等环境 样品和电子产品、纺织印染品、建筑装潢等产品中痕量溴代阻燃剂四溴双酚A的检测。
[0033] 与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：
[0034] (1)半抗原实用性强：TBBPA半抗原制备和抗体制备具有重要的实用价值和现实 意义。该半抗原保留了TBBPA的结构，再利用碳化二亚胺法、活化酯法或混合酸酐法偶联蛋 白质使其具有针对TBBPA的抗原决定簇，可成功制备TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA或TBBPA 人工包被原TBBPA-0VA，为制备特异性好、效价高的抗体和建立免疫PCR生物条形码方法提 供了保障。
[0035] (2)半抗原稳定性好：本发明首次制备获得了TBBPA半抗原，且此法合成的TBBPA 半抗原结构具有较好的稳定性，在室温状态下可保存多年，几乎不会失效。
[0036] (3)半抗原制备技术简便可行：半抗原的整个制备过程无需特别的仪器设备，成 本低廉，且制备速度快，产率高，容易工业化规模生产。
【附图说明】
[0037] 通过阅读参照以下附图对非限制性实施例所作的详细描述，本发明的其它特征、 目的和优点将会变得更明显：
[0038] 图1为TBBPA的红外光谱图；
[0039] 图2为TBBPA半抗原的红外光谱图；
[0040] 图3为TBBPA半抗原的核磁共振谱图；
[0041] 图4为TBBPA半抗原TBBPA-hapten、载体蛋白BSA和人工全抗原TBBPA-BSA的紫 外光谱图；
[0042] 图5为TBBPA半抗原TBBPA-hapten、载体蛋白0VA和人工全抗原TBBPA-0VA的紫 外光谱图。
【具体实施方式】
[0043] 下面结合具体实施例对本发明进行详细说明。以下实施例将有助于本领域的技术 人员进一步理解本发明，但不以任何形式限制本发明。应当指出的是，对本领域的普通技术 人员来说，在不脱离本发明构思的前提下，还可以做出若干变形和改进。这些都属于本发明 的保护范围。
[0044]实施例1多溴联苯半抗原的制备
[0045]称取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 294g(7. 354mmol)氢氧化钠溶解在 8mLN,N-二甲 基甲酰胺中，逐渐升温到80°C。称取0. 5109g