(3. 677mmol)溴乙酸溶解在5mLN,N-二甲基甲 酰胺，将其逐滴加入到80°C热反应液中，随后保持恒温回流反应4~6小时，直至薄板层析 法（TLC)检测原料点消失为止。反应结束后冷却至室温，向反应液中加入30mL蒸馏水，用浓 盐酸调节pH至3. 0,此时会有大量白色沉淀生成；随后，向混浊液中加入60mL乙酸乙酯，分 离并保存有机层；此时，用水多次重复洗涤有机相以尽量除去反应副产物，之后再用无水硫 酸钠干燥。将干燥后的有机相转移至旋转蒸发仪中除去多余的溶剂，得淡黄色粗品。粗品用 丙酮溶解，过层析柱分离纯化（展开剂，正己烷：丙酮=4:1 (V:V))，最终得到淡黄色针状结 晶体即TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羟苯基）异丙酯））乙酸。TBBPA 半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;产率：67. 5%，熔点：167-170°C，纯度：98%。
[0046]实施例2多溴联苯半抗原的制备
[0047]称取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 588g(14. 708mmol)氢氧化钠溶解在 8mLN,N-二 甲基甲酰胺中，逐渐升温到85°C。称取1.0218g(7. 354mmol)溴乙酸溶解在5mL二甲亚砜 中，将其逐滴加入到85°C热反应液中，随后保持恒温回流反应4~6小时，直至薄板层析法 (TLC)检测原料点消失为止。反应结束后冷却至室温，向反应液中加入30mL蒸馏水，用浓盐 酸调节pH至4. 0,此时会有大量白色沉淀生成；随后，向混浊液中加入60mL乙酸乙酯，分离 并保存有机层；此时，用水多次重复洗涤有机相以尽量除去反应副产物，之后再用无水硫酸 钠干燥。将干燥后的有机相转移至旋转蒸发仪中除去多余的溶剂，得淡黄色粗品。粗品用 丙酮溶解，过层析柱分离纯化（展开剂，正己烷：丙酮=4:1 (V:V))，最终得到淡黄色针状结 晶体即TBBPA半抗原2- (2, 6-二溴-4- (2- (3, 5-二溴-4-羟苯基）异丙酯））乙酸。TBBPA 半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;产率：68. 5%，熔点：167-170°C，纯度：98%。
[0048]实施例3多溴联苯半抗原的制备
[0049]称取 2g(3. 677mmol)TBBPA和 0? 294g(7. 354mmol)氢氧化钠溶解在 8mLN,N-二甲 基甲酰胺中，逐渐升温到80°C。称取1.0218g(7. 354mmol)溴乙酸溶解在5mLN，N-二甲基 甲酰胺中，将其逐滴加入到80°C热反应液中，随后保持恒温回流反应4~6小时，直至薄板 层析法（TLC)检测原料点消失为止。反应结束后冷却至室温，向反应液中加入30mL蒸馏 水，用浓盐酸调节pH至2. 0,此时会有大量白色沉淀生成；随后，向混浊液中加入60mL乙酸 乙酯，分离并保存有机层；此时，用水多次重复洗涤有机相以尽量除去反应副产物，之后再 用无水硫酸钠干燥。将干燥后的有机相转移至旋转蒸发仪中除去多余的溶剂，得淡黄色粗 品。粗品用丙酮溶解，过层析柱分离纯化（展开剂，正己烷：丙酮=4:1(V:V))，最终得到淡 黄色针状结晶体即TBBPA半抗原2-(2, 6-二溴-4-(2-(3, 5-二溴-4-羟苯基）异丙酯））乙 酸。TBBPA半抗原分子式：C17H14Br404;分子量：601. 92 ;产率：69%，熔点：167-170°C，纯度： 98%〇
[0050] 获得的TBBPA半抗原，其结构通过红外光谱、紫外可见光谱、核磁共振等检测 手段分析鉴定，TBBPA半抗原的红外光谱特征如下：IR(KBr)v/cm1:3475. 69 (0-H伸 缩），1733.86化=0伸缩），1577.22、1472.99化=(：苯环骨架振动），875.55、778.72、 734.95(C-H弯曲），621.08(C-Br伸缩），从图1和图2的红外图谱结果分析看出，TBBPA半 抗原具有与TBBPA分子相似的光谱结果，且TBBPA半抗原红外光谱中有明显的-COOH基团 特征峰，证明制备的TBBPA半抗原分子中含有羧基官能团。
[0051]TBBPA半抗原的核磁共振氢谱图如图3所示，其特征如下NMR(⑶Cl3)S(ppm ):11. 5 (1H，C00H)，7. 31 (2H，AromaticH)，4. 19 (2H，- 0CH2C00H)，2. 50 (1H，OH)，1. 60 (6H，2 CH3)。红外、核磁表征结果表明，实验成功制备了TBBPA半抗原。
[0052]实施例4多溴联苯人工全抗原的制备
[0053] 本发明制备的多溴联苯半抗原，主要应用在环境中多溴联苯的免疫检测中。它的 主要用途之一，就是可以用来直接和蛋白质大分子偶联，制备出用来免疫动物的免疫原，进 而制备出相应的单克隆或多克隆抗体。在此基础上建立多溴联苯的免疫测定方法。下面就 TBBPA半抗原的使用做以下应用举例：
[0054] 采用活化酯法制备TBBPA-BSA免疫原，具体合成步骤：称取0. 3010gTBBPA半抗原 于小锥形瓶中，加入lmLN，N' -二甲基甲酰胺使之溶解；称取0. 0575gN-羟基琥珀酰亚胺 和0. 103gN，N'-二环己基碳酰亚胺溶于lmLN，N' -二甲基甲酰胺中，将含有NHS和DCC 的N，N' -二甲基甲酰胺溶液逐滴加入到TBBPA半抗原溶液中，室温下搅拌反应6-12小时， 4°C过夜，低温离心分离上清液。称取120mgBSA溶于10mL0. 01MpH7. 40的PBS缓冲液 中，将上述上清液逐滴加入BSA溶液中，4°C反应2-6小时；反应后，将溶液装入透析袋，用 0. 01MpH7. 40的PBS缓冲液透析3天，每八小时换水一次；透析后离心分离上清液，即得 TBBPA人工免疫原TBBPA-BSA，经紫外-可见分光光度计鉴定后，小量分装，-20°C冷冻保存。
[0055] 通过混合酸酐法制备TBBPA-0VA包被原，具体合成步骤：称取0. 5mmolTBBPA半抗 原于小锥形瓶中，加入lmLN，N' -二甲基甲酰胺使之溶解，顺次加入等摩尔的正丁胺和氯 甲酸异丁酯，4°C磁力搅拌2-3小时。称取120mg0VA溶于10mL0? 01MpH7. 40的PBS中， 将半抗原反应液逐滴加入到OVA溶液中，4°C搅拌反应5小时；反应结束后，装入透析袋，用 0. 01MpH7. 40的PBS透析3天，每八小时换水一次，4°C低温离心分离上清液，即得包被原 TBBPA-0VA。包被原经紫外-可见分光光度计鉴定好，小量分装，-20°C冷冻保存。
[0056] 偶联物经紫外可见分光光度计扫描鉴定后，从图4和图5的TBBPA半抗原、载体蛋 白和人工全抗原紫外光谱图中可以看出，TBBPA半抗原的特征吸收峰位于287nm;载体蛋白 BSA的特征吸收峰位于227nm和273nm处；载体蛋白0VA的特征吸收峰出现在219nm、224nm、 268nm处。偶联物TBBPA-BSA和TBBPA-0VA的紫外光谱中不仅分别包含BSA和OVA的特征 峰，还在317nm和312nm处出现了新的吸收峰，以上信息表明TBBPA-BSA和TBBPA-0VA偶联 成功。
[0057] 这些免疫原既可以用于免疫动物，通过动物产生的免疫反应得到可以用来做免疫 分析的单克隆或多克隆抗体，又可以作为免疫竞争对象而使用。
[0058] 以上对本发明的具体实施例进行了描述。需要理解的是，本发明并不局限于上述 特定实施方式，本领域技术人员可以在权利要求的范围内做出各种变形或修改，这并不影 响本发明的实质内容。
【主权项】
1. 一种多溴联苯同系物半抗原，其特征在于，结构式如式（I)所示：2. -种如权利要求1所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，包括以 下步骤：3. 如权利要求2所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，所述TBBPA与 溴乙酸在碱性环境中反应具体包括： Al、将TBBPA和碱金属氢氧化物溶解在非质子性有机溶剂中，得溶液A，逐渐升温； A2、将溶解于非质子性有机溶剂的溴乙酸逐滴加入到步骤Al中升温后的溶液A中，随 后保持恒温回流反应，直至原料点消失为止。4. 如权利要求3所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，所述非质子 性有机溶剂为N，N-二甲基甲酰胺、二甲亚砜或丙酮。5. 如权利要求3所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，所述的 TBBPA、碱金属氢氧化物和溴乙酸的摩尔比为1:2~4:1~2。6. 如权利要求3所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，步骤A2中，所 述溶液A的温度为80~85°C，恒温回流反应时间为4~6小时。7. 如权利要求2所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，还包括以下 步骤： B、 反应结束后用浓盐酸调节pH终止反应； C、 向反应液中加入乙酸乙酯，分离并水洗、干燥有机相； D、 将干燥后的有机相去溶剂，过层析柱分离纯化，得到纯化后的TBBPA半抗原，即所述 多溴联苯同系物半抗原。8. 如权利要求7所述的多溴联苯同系物半抗原的制备方法，其特征在于，步骤B中，所 述pH为2. 5~3. 5 ;步骤D中，所述层析柱分离纯化的薄层层析展开剂采用体积比为1:4的 丙酮和正己烷组成的混合溶液。9. 一种如权利要求1所述的多溴联苯同系物半抗原的用途，其特征在于，用于痕量溴 代阻燃剂TBBPA的检测。10. 如权利要求9所述的多溴联苯同系物半抗原的用途，其特征在于，所述痕量溴代阻 燃剂TBBPA的检测方法，包括将所述多溴联苯同系物半抗原通过碳化二亚胺法或混合酸酐 法或活化酯法与载体蛋白偶联制备TBBPA人工全抗原。
【专利摘要】本发明提供了一种多溴联苯同系物半抗原及其制备方法，所述多溴联苯同系物半抗原结构式如下：其制备方法为TBBPA与溴乙酸在碱性环境中反应，在TBBPA分子酚羟基基团末端引入一个羧基基团即得。所述多溴联苯同系物半抗原制备方法简便，稳定性好，成本低，容易工业化生产；TBBPA半抗原通过碳化二亚胺法或混合酸酐法或活化酯法与载体蛋白偶联制备TBBPA人工全抗原，为制备特异性好、效价高的抗体和建立免疫PCR生物条形码方法提供了保障。
【IPC分类】C07K14/765, G01N33/531, C07C51/367, C07C59/70, G01N33/53, C07K14/77
【公开号】CN105130787
【申请号】CN201510471283
【发明人】庄惠生, 孙瑞艳, 卜聃
【申请人】上海交通大学
【公开日】2015年12月9日
【申请日】2015年8月4日