一种抑制向日葵茎溃疡病菌生长的化合物的制作方法
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化合物的新用途，阐明药物化学结构与细菌的生物活性之间的关系， 更具体的说，是探索化合物对向日葵茎溃疡病菌的抑菌和杀菌活性。
【背景技术】
[0002] 向日葵原产于美洲，英文名：sunflower，为菊科植物，其野生种主要分布在北韩 30° ~52°之间的北美洲南部、西部以及秘鲁和墨西哥北部地区，由本地人将野生作物驯化 为农业作物。向日葵分油用型、实用型和中间型3种类型，油用型即油葵，已成为世界仅次 于大豆的第二大食用油料作物，油葵的籽实含油量一般在45%以上。在国际上，向日葵是公 认的品质优良的油料作物之一。由于向日葵生育期较短、耐干旱、耐贫瘠等特点，在我国向 日葵主产区分布在东北、西北和华北地区。
[0003] 由于向日葵用途广、功效强，因此具有很高的经济和药用价值。近几年来，美国向 日葵产量戏剧性地上升，在美国油料生产中占有很重要的地位。随着国际种子贸易的发展， 我国对向日葵种子的引进在不断增加，并且大面积种植引进的优质品种。但是由于引种不 当，在引入优良品种对生产起到积极作用的同时，种子上携带的有害生物扩散对向日奏自 身也具有毁灭性危害。向日葵生产中受到多种病害的侵染，全世界已报道向日葵病害90 种，其中欧洲、美国和澳大利亚有45种，中国和南斯拉夫各发现有25种，是世界上向日葵病 害最多的两个国家。
[0004] 向日葵油富含蛋白质、不饱和脂肪酸、亚油酸、维生素E等对人体有用的成分，是 一种优质的食用油。向日葵的经济价值高，其富含的脂肪酸亚油酸可以降低人体胆固醇，防 治动脉硬化等作用；向日葵油富含维生素E，研究表明，人体吸收适量的维生素E可促进机 体免疫和生殖发育等作用；向日葵油的副产品油饼籽是造蛋白糕点、油漆等好原料；向日 葵的莲杆和花盘也具有一定的经济价值，莲杆可以用作建筑材料，花盘可以作为畜禽的好 词料。
[0005] 向日葵性味甘、平，无毒，可平肝祛风，祛湿热，消滞气等功效。其中向日葵籽性味 甘平，入大肠经，可驱虫止痢，具有防癌作用；向日葵莲叶花可清肝明目，具有抗菌消炎作 用；向日葵根和茎髓具有健脾利尿和清热利湿等作用，因此可以从像向日葵此种自然植物 中提取天然成份来治愈疑难杂症，向日葵一身是药，具有很高的药用价值。
[0006] 我国向日葵种植面积约200万吨，主要生产区集中在内蒙古、新疆、东北三省、河 北、山西、以及西北地区的宁夏、甘肃等地。在我国主要油料作物有大豆、花生、油菜籽、棉籽 和向日葵轩等，其中向日葵籽产量达170~190万吨，在油料生产中排名第五并具有上升趋 势。目前我国生产应用向日葵品种分为两类：油用向日葵品种和食用向日葵品种。而长期 种植单一品种会造成品种抗病、抗倒能力降低，空壳率高，造成产量和品质下降。我国在国 外引种历史悠久，随着国际贸易日趋发展，向日葵油作为一种富含不饱和脂肪酸的保健油 人们对其需求量加大，使得向日葵在我国进口量有增无减，且从国外引进优良向日蔡品种 使我国向日葵品种的单一性得到缓解。
[0007] 向日葵茎溃疡病菌无性态为半知菌亚门，腔孢纲，球壳孢目，拟莲点霉属，病原 菌无性分生孢子器分生孢子器梓檬黄色或浅褐色，直径约为150~350lim，含有a和员 两种类型的分生孢子。a分生孢子无色、单胞，纺锤形或椭圆形，常有2~4个油滴，大 小为8~21 X 1. 7~5. 5 ym ; 0分生孢子无色、单胞，丝状线形，一端常为钩状，无油球，大 小16~4X0. 5~6.9ym。向日葵茎溃疡病菌有性态为子囊菌亚门，核菌纲，球科目，间座 壳科，间座壳属。向日葵茎溃疡病菌的有性器官子囊壳直径350~450 ym，有緣状突起长 350~600 y m ;子囊无色，大小44~67 y mX 7. 5~12. 5 y m，含8个子囊孢子；子囊孢子双胞、无 色、椭圆形，大小 12. 5~19 ymX2. 8~7. 5 ym。
[0008] 向日葵茎溃疡病菌可侵染向日葵植株的莲、叶片、荚和种子等所有地上器官。茎杆 和叶柄结合处有灰褐色病斑，逐渐变成暗灰或黑色，病斑可扩散包围莲杆，导致茎杆上部干 枯易折断，茎杆和叶柄髓部腐烂坏死；叶片病斑棕色或黑色，整叶萎蔫、干枯变黑；葵盘发 育不良，不能形成成熟的种子，干枯败育，病害严重时整个植株死亡。
【发明内容】
[0009] 本发明采用体外抗菌试验，研究化合物对向日葵茎溃疡病菌的生物活性。
[0010] 本发明的具体技术方案如下： 本发明的创新点是发现化合物对向日葵茎溃疡病菌有良好的抑菌和杀菌活性，并测量 得到其最小抑菌浓度MIC值和最小杀菌浓度MBC值，属于首次公开。
[0011] 所述化合物结构特征如下式所示：
【具体实施方式】
[0012] 下面结合具体实施实例，进一步详细地说明本发明。应理解下面实施例仅用于说 明本发明而不用于限制本发明范围。
[0013] 实施实例1 测量最小抑菌浓度MIC值。
[0014] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0015](2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0016] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0017] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 y L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数。
[0018] 计算公式为：菌液浓度=nX20X100cfu/mL (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存放 于4°C冰箱保存待用。
[0019] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小抑菌浓度MIC(MinimalInhibitoryConcentration)。MIC为最小抑菌浓度，即药物 与一定浓度的菌液作用后，能够抑制可见菌生长的最低浓度。
[0020] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为1~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照，第 12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物最 低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC，每个实验重复三次。
[0021] 测得最小抑菌浓度MIC值为0? 5yg/mL。
[0022] 实施实例2 测量最小杀菌浓度MBC值。
[0023] (1)营养肉汤的配制：取营养肉汤30g加1000mL蒸馏水即得。使用前121°C高压 蒸汽灭菌20min待用。
[0024] (2)营养琼脂固体培养基的配制：取营养琼脂45g加1000mL蒸馏水即得。使用前 121°C高压蒸汽灭菌20min待用。
[0025] (3)菌株的培养：操作于超净工作台上进行。吸取已灭菌的液体培养基10mL，放在 已灭菌的试管中，然后用接菌环挑取一个菌落，加到液体培养基中，放于培养箱内培养，细 菌培养24h，培养温度为28°C。
[0026] (4)菌液配制及计数：将培养后的菌液，釆用10倍稀释法用液体培养基稀释，并 用血球计数板在显微镜上初步观察计数，然后将菌液用液体培养基稀释，作为加入供试品 中的菌液。细菌采用平板计数法进行计数，将以上菌液用无菌生理盐水再稀释100倍，取 50 y L，均匀涂于已铺有固体培养基的平皿中，培养24h，培养温度为28°C。培养后，单个活 细菌生长形成一个菌落，统计菌落数目，即可计算出样品中的含菌数；计算公式为：菌液浓 度=nX20X 100cfu/mL。
[0027] (5)药品溶液的配制：称取化合物，加入灭菌生理盐水，摇勾，得均匀溶液，备用。存 放于4°C冰箱保存待用。
[0028] (6)最小抑菌浓度（MIC)与最小杀菌浓度（MBC)的测定：采用微量肉汤稀释法测定 最小杀菌浓度MBC(MinimalBactericidalConcentration)。在MIC基础上，从每管吸取 10yL溶液，点于固体培养基上，继续按MIC培养条件下培养，以完全杀灭细菌的最低浓度 为最小杀菌浓度(菌落数小于等于5)。
[0029] 采用二倍稀释法将药液用无菌生理盐水将药液稀释系列浓度，0.5、1、2、4、8、16、 32、64、128和256 yg/mL，在96孔板上1~10行，每孔加100yL不同浓度的药液和100yL 菌液，使最终菌液浓度为l~5X105cfu/mL，第11行以无菌生理盐水加菌液作为阳性对照， 第12行以不加菌液的无菌生理盐水为阴性对照，混匀后于28°C培养24h，以肉眼观察药物 最低浓度管中无细菌生长者为该试验药物的MIC。将上述未见生长细菌的各孔中的肉汤取 10 y L接种于营养琼脂平板上，做好标记，于28°C培养24h，以仍无细菌生长的管内药物浓 度记为该药的MBC，每个实验重复三次。
[0030] 测得最小杀菌浓度MBC值为2 y g/mL。
【主权项】
1. 一种抑制向日葵茎溃疡病菌生长的化合物，其特征在于： (1) 结构特征如下式所示：(2) 其可作为向日葵茎溃疡病菌的抑制剂和杀菌剂； (3) 其对向日葵茎溃疡病菌的最小抑菌浓度MIC值为0. 5 μ g/mL ; (4) 其对向日葵茎溃疡病菌的最小杀菌浓度MBC值为2 μ g/mL。
【专利摘要】本发明发现对向日葵茎溃疡病菌具有抑菌和杀菌活性的化合物。其向日葵茎溃疡病菌的最小抑菌浓度MIC值为0.5μg/mL，最小杀菌浓度MBC值为2μg/mL。
【IPC分类】A01P3/00, C07D413/04
【公开号】CN105153139
【申请号】CN201510726300
【发明人】不公告发明人
【申请人】许自协
【公开日】2015年12月16日
【申请日】2015年11月2日