一种生物素活泼酯及其合成方法、用图
【技术领域】
[0001] 本发明涉及化学合成领域，更特别涉及一种生物素活泼酯及其合成方法、用途。
【背景技术】
[0002] 生物素（Biotin)侧链上有一个羧基，羧基可与氨基、羟基等反应生成新的化合物， 因而通过改变生物素分子中的侧链部分，可合成不同种类的生物素衍生物。例如，可通过 生物素末端羧基的反应将生物素转化为含活泼酯的衍生物，生物素活泼酯类化合物广泛用 于核酸、蛋白质等生物分子的非放射性标记，其标记物不仅可用作各种正常、异常基因和蛋 白质检测的探针或信号分子，而且近年来还被用于特定核酸和蛋白质的亲和色谱分离或分 析。
[0003] 生物素-N-琥珀酰亚胺酯（Biotin-OSU)是目前普遍采用的一种生物素活泼酯，但 由于其琥珀酰亚胺酯结构离去性非常强，不适合长期稳定保存，一般都需要现制现用，使用 上很不方便。此外，琥珀酰亚胺酯结构活性较高，标记蛋白质中的氨基时不具备选择性，这 些都局限了其应用。因而，急需研发一种更稳定的，选择性较强的生物素活泼酯。
【发明内容】
[0004] 为克服现有技术中的上述问题，本发明提供了一种新的生物素活泼酯及其合成方 法，该生物素活泼酯具有良好的稳定性和选择性，可以更好地标记蛋白质中的氨基，应用于 生物分离、检测等，且其合成方法简便，产率较高。
[0005] 本发明采用的技术方案是： 在一方面，本发明提供了一种生物素活泼酯，其具有以下化学式： (I)0
[0006] 该生物素活泼酯的化学名称为：生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺 酯（Biotin-ONB)，可作为一种新型的生物素活泼酯代替生物素-N-琥珀酰亚胺酯应用，具 有更好的选择性和稳定性，可长期稳定保存。
[0007] 在另一方面，本发明还提供了上述生物素活泼酯的合成方法，包括以下步骤：生物 素与N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺（HONB)在溶剂中反应，生成式（I)化合物生 物素活泼酯。
[0008] 该合成方法的反应路线如下：
[0009] 进一步地，生物素与N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺在有机溶剂中，在缩 合剂的作用下发生缩合反应，生成式（I)化合物生物素活泼酯。
[0010] 优选地，上述缩合剂为N,N'-二环己基碳二亚胺（DCC)、N,N'-二异丙基碳二亚 胺（DIC)或EDC盐酸盐。
[0011] 具体地，上述有机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、二 氧六环中的一种或几种。
[0012] 更进一步地，生物素与氯化亚砜或草酰氯反应得到中间体，然后该中间体与N-羟 基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺（HONB)在有机溶剂中反应，得到式（I)化合物生物素活 泼酯。
[0013] 优选地，中间体与N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺（HONB)反应使用的有 机溶剂选自N，N-二甲基甲酰胺、二甲基亚砜、二氯甲烷、乙腈、二氧六环中的一种或几种。
[0014] 优选地，生物素与N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺（HONB)在溶剂中在室 温下进行反应，更优选地，在20-50°C下反应。
[0015] 优选地，生物素与N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺（HONB)在溶剂中反应 的时间为12-24小时，优选16-20小时。
[0016] 更进一步地，该生物素活泼酯的合成方法还包括对反应后生成的粗产品进行重结 晶的步骤，重结晶使用的溶剂为异丙醇，但并不限于此，也可以使用能对该粗产品进行重结 晶以进一步提纯粗广品的其他溶剂。
[0017] 在又一方面，本发明还提供了一种上述生物素活泼酯作为蛋白质标记试剂的用 途。
[0018] 此外，本发明中所使用的有机溶剂等试剂并不局限于所描述的种类，能起到相当 效果的其他试剂也应包含在本发明的保护范围内。
[0019] 与现有技术相比，本发明具有以下优点：本发明提供了一种新的蛋白质标记试剂 生物素活泼酯"生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯（Biotin-ONB)"，及 其合成与提纯方法。该方法路线简单，产率较高，纯度达到了 98%以上。该生物素活泼酯 Biotin-ONB的稳定性高，可以室温条件下稳定保存半年以上，可替代目前已广泛使用的稳 定性较差的Biontin-OSU作为蛋白质标记试剂用于生物检测、分离等领域中，且具有良好 的氨基选择性，这对其他生物素活泼酯的合成和应用具有重要的参考价值，进而可以提供 启示以合成很多含生物素的衍生物，扩大了生物素的应用范围。
【具体实施方式】
[0020] 下面结合具体实施例对本发明进行进一步详细说明。
[0021] 实施例1 向500ml三口瓶中加入24. 4g生物素和18. 8gN-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚 胺（HONB)其中，再加入300mlDMF，冰水浴冷却下滴加22. 7gDCC，体系中有固体D⑶生成， 滴加完毕，撤去冰浴，室温反应16小时，抽滤，滤饼用少量DMF洗涤，滤液蒸干，用异丙醇重 结晶，得到31. 2g生物素活泼酯，即生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯，摩 尔收率为77%，HPLC纯度98. 5%。
[0022] 该实施例1所制备的生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯的核磁 数据如下： HNMR (400 MHz, DMS0)：8 6. 43 - 6. 33 (2H, m), 6. I (2H, br), 4. 37 - 4. 27 (1H, m), 4.18-4.12 (1H, m),3. 5 (2H, br), 3. 12 - 3. 07 (1H, m),2. 88-2. 81 (1H, m), 2. 68 -2. 52 (3H, m)，I. 69 - I. 23 (9H, m)，I. 69 - I. 23 (9H, m)。
[0023] 实施例2 向500ml三口瓶中加入24. 4g生物素和18. 8gH0NB，再加入300mlDMF，冰水浴冷却下 滴加13. 9gDIC，滴加完毕，撤去冰浴，室温反应24小时，抽滤，滤饼用少量DMF洗涤，滤液用 IL异丙醇兑入，有大量固体析出，抽滤，滤饼再用异丙醇重结晶，得到28.Ig生物素活泼酯， 即生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯，摩尔收率为69%，HPLC纯度98. 1%。
[0024] 该实施例2所制备的生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯的核 磁数据如下：HNMR(400MHz，DMS0):S6. 43 - 6. 33 (2H,m)，6.I(2H,br)，4. 37 - 4. 27 (1H,m),4. 18-4. 12 (1H,m), 3. 5 (2H,br), 3. 12 - 3. 07 (1H,m),2. 88-2. 81 (1H,m), 2. 68 - 2. 52 (3H,m)，I. 69 -I. 23 (9H,m)，I. 69 -I. 23 (9H,m)。
[0025] 实施例3 向500ml三口瓶中加入24. 4g生物素和18. 8gH0NB，再加入200ml二氧六环和21.Ig EDC盐酸盐，室温反应12小时，抽滤，滤饼用少量乙腈洗涤，再用异丙醇重结晶，得到26.Ig 生物素活泼酯，即生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰亚胺酯，摩尔收率为64%， HPLC纯度 98. 1%。
[0026] 该实施例3所制备的生物素-N-羟基-5-降冰片烯-2，3-二甲酰