接缓冲液中并逐滴添加0.OI血的200mM水性NaN〇2而 氧化。将反应进行26分钟并且然后通过添加溶解在0.ImL连接缓冲液（pH= 7,RT)中的 3.ImgMPAA和0. 78mgTCEP?肥1来巧灭。将抑调节至7并且向反应混合物添加0. 3mg的 片段切S-[40-58]-C0NH2。两小时室溫连接之后，将混合物用0. 2ImL缓冲液P稀释然后进一 步用0. 63mL缓冲液P稀释W折叠所得的亲和体。粗混合物在3kDa膜之上浓缩成0. 075mL 的最终体积。粗的经折叠蛋白质用3mL缓冲液P中的36mgTCEP?肥1稀释并纯化至均一 (图 9)。
[0122] 图9A-犯示出了纯化的亲和体合成中间体和最终产物的LC-MS色谱图。图9A-犯 是（a)片段[1-27]03畑畑2、化）片段Iliz-巧8-39]-〇)畑畑2、（C)片段切s-[40-58]-C0NH2、 (d)连接片段[1-39]-C0NHNH2和（e)最终的亲和体的色谱图。 阳123] 比较实施例6
[0124] 该实施例描述了使用常规手动Boc原位中和方法合成亲和体。
[01巧]使用手动Boc原位中和方法合成比较的亲和体片段。运些粗肤的LC-MS数据示于 图8A-8F中，紧邻在基于流动的SPPS平台上合成的粗肤。在所有情况中，品质是可比较的。 保留时间漂移是由于色谱条件的改变和制备的用于用Boc和Fmoc策略连接的稍微不同的 肤。 阳126] 实施例7
[0127] 该实施例描述了用于基于流动的SPPS系统的设计。在整个该实施例中，所述系统 是指作为合成仪。合成仪的一个示意图示于图2A中。HPLC累用于递送甲醇清洗溶剂W在 使用之后洗涂累压头（pumphead)、反应器和UV检测器；DMF洗涂溶剂用于除去合成期间的 试剂和副产物；或者含50% (v/v)赃晚的DMF用于N-末端的去保护。阀1和阀2的位置 决定递送哪个流体。注射累用于递送偶联溶液。为了在注射累与HPLC累之间切换，W手动 的方式将快速连接器从HPLC累的出口移动至注射累上的注射器。因为注射累与阀之间的 管线将保留偶联溶液，所W阀通常是无效的，从而引起下一个循环中不正确的渗入。将柱和 1.2mL预热回路（未示出）浸没在水浴中W维持恒定的60°C。阀3和阀4选择高压旁路回 路用于当UV检测器被沉淀物（例如半脫氨酸外消旋作用研究期间所遇到的DCC活化的尿 素副产物）阻塞时清洗UV检测器。所述回路还用于净化管线中没有柱的检测器。
[0128] 将VarianProstar210HPLC累、邸Scientific邸S200 注射累、设定为 304nm 的VarianProstar320UV检测器、AmershamPharmaciaBiotech图表记录仪和VWR 39032-214水浴用于合成仪中。HPLC累递送约95%的标称流量。将一次性10血注射器 度D309604)用于递送偶联溶液。阀1是Swagelok1/8" 3向阀（S5-41GXS2)。所述系统 中的其他阀是Swagelok1/16" 3向阀（SS-41GXS1)。通过阀1直至阀2的甲醇、DMF和 50% (v/v)赃晚管线是1/8" 0D，1/16"ID阳Pddex1521)。阀3与阀4之间的管线是 1/16" 0D，0.010 "IDpeek(Idex1531)。所有其他管线是 1/16" 0D，0.030"IDPFAQdex 151化）。为了将1/8"洗涂和去保护管线连接至阀2的1/16"入口，使用Swagelok1/8" 至1/16" (SS-200-6-1)异径活接头，随后使用短段的1/16"管。除了快速连接器与反应器 之间的管，使所有长度最小化。运包括2. 6m(1.2mL)线圈（coil),其与反应器一起浸没并且 作为预热回路W确保反应物在到达反应器之前为60°C。当不得不连接管时，使用Swagelok 1/16"活接头（SS-100-6)。将运些用于连接预热回路，将柱的出口与来自阀4的管线连接 并且修复受损的旁路回路（severedbypassloop)。手动改变的快速连接器是10-32凹型HPLC接头（fitting)的凹型鲁尔接口（Iuer)QdexP-659)。其直接连接至注射累上的注 射器或者连接至来自阀3管线上10-32凹型接头的相配的凸型鲁尔接口（IdexP-656)。UV 检测器与图表记录仪之间的连接是数据链路（datalink)(=个ISga绝缘的铜线）。
[0129] 图2B示出了反应器组件。反应器由在每端具有标准压力接头（3/8"至1/16"异 径活接头）的管组成。在下游端还存在玻璃料。运通过设计成安装在反应器内部并抵靠在 那个端部上之接头底部的支持物定位。使用多种玻璃料孔隙率。下面的零件编号为最常用 的20微米的玻璃料。主体是3.5英寸PFA管段，外径为3/8"并且内径为1/4"。玻璃料是 1/4"烧结的不诱钢盘，1/16"厚。玻璃料支持物是0.5"长度的1/4"ODPT阳管。当上紧 接头时，螺母将套圈压向接头主体，将反应器主体密封至接头主体。运还将反应器主体压向 玻璃料，从而形成针对玻璃料的内部密封。反应器主体和玻璃料购自McMaster-Carr,零件 编号分别为S1805K73和94461314。螺母、套圈和接头主体W-套来自Swagelok零件编号 为SS-600-6-1的1/16"螺母和套圈可得。替换套圈WSS-600-SET可得。通过将主体和玻 璃料支持物首先切割成确保端部是正方形的长度来组装反应器。锋利刀片和稳定的手用于 运些操作。接下来，组装出口（下游）端。将玻璃料放置在实屯、、干净的表面上并且将反应 器主体压在其上。在验证玻璃料是正方形并与反应器端部平齐之后，将玻璃料支持物稍微 推动，从而将玻璃料向上推向其最终位置。将反应器主体稳固放置在接头主体中迫使玻璃 料至其最终位置。验证玻璃料是正方形并适当地定位在套圈下，然后根据制造商的说明书 安装接头。一旦被密封，就不能除去和重新放置玻璃料。最后，根据制造商的说明书安装入 口接头。还建造了具有不诱钢主体的高压反应器。在该情况中，下游接头不得不被很好地 远远超出规范地上紧W影响用玻璃料的密封。通常每3至8个合成中替换反应器。当替换 反应器时，不重复使用套圈、玻璃料和反应器主体。重复使用所有其他的零件。通过将反应 器主体切成两半来回收螺母。
[0130] 为了装载反应器，除去上游接头主体并且用吸移管加入甲醇中的树脂浆料。完全 用甲醇填充反应器并且重新安装接头主体。入口管线和预热回路通过将其连接至快速连接 器和在将其连接至反应器之前运行HPLC累来用溶剂填充。然后将反应器在水浴中保持垂 直W使得任何小气泡将移动至顶部而不干扰树脂的润湿。在第一次偶联之前，将树脂用DMF WIOml/分钟洗涂两分钟。
[0131] 实施例8
[0132] 该实施例描述了用于实施例10至11和13至17中基于流动的SPPS的大规模反 应器的设计，其允许更快的循环时间并增加合成规模。在整个实施例中，不同于实施例7中 所述的"第一代"反应器，该反应器被称作"第二代"反应器。 阳133] 图12示出更大的反应器。将用于将实施例1至7中所有合成的小规模反应器（即 第一代反应器）的设计原理直接转变为更大的规模。然而，为了保存可比较的循环，反应 器的体积必须恒定。当规模增大至5/8" 0D、1/2"ID管时遇到两个问题。第一，没有标准 5/8"至1/16"的压合接头（compressionfitting)。第二，5/8"接头之间的最小距离相 当大，意味着存在大的最小体积。为了克服第一个问题，使用5/8"至3/8"接头，随后使用 3/8"至1/16"接头，但是运需要连接长度为3/8"的管，运大大增加了反应器已有的大体 积。
[0134] 为了减小反应器体积，机械加工316SS插入件（insed)，所述插入件由标称 1/2"OD段和随后具有1/4"通孔的3/8"OD段组成。将5/8"至3/8"异径活接头僮孔 W得到3/8"通孔，放置插入件并且将3/8"套圈套（swage)在其上。在运之后，不能将插 入件与接头分离。当安装时，该插入件接头的1/2"零件位于反应器的顶部中并限制体积。 阳135] 运是有效的，但是仍然存在来自1/4"通孔的大体积。通过插入1/4" 0DU/8"ID PFA管并将其切割平齐来减小该体积。为了进一步减小体积，通过将管的一部分加热并拉伸 成较窄的直径来插入1/8" 0DU/16"IDPFA管、将其贯穿和拉出直到插入件中的所有管 具有合适的直径。所述管的两侧均被切割平齐并且丢弃拉伸的部分。将3/8"至1/16"异 径活接头安装在3/8"段的开口端上W与系统的其余部分联系。该插入接头在图12A(左 面）中示出。为了防止上游插入接头像玻璃料一样永久地被密封在管中，将标称1/2"段机 械加工成0.496"并进行抛光。 阳136] 将相似件机械加工用于出口侧，具有1/2"段，该长度合适地位于套圈下的玻璃料。 为了防止所有溶剂被强迫通过玻璃料的小中屯、段，W3/8"直径阶梯切割0.05"深。该阶 梯的底部递变成与水平线31°的1/8"通孔（标准钻头锥）。插入1/8" 0D、1/16"IDPFA 管W进一步限制体积。出口插入件的1/2"段位于玻璃料并位于远低于套圈位置处，所W标 准的磨光（finish)是足够的。图12A中所示的一个是PTFE并且W与上游插入件完全相同 的方式安装在穿过5/8"至3/8"异径活接头的膛中。包括图12F所示剖面中的一个的随 后反应器使用不诱钢出口插入件。将3/8"至1/16"异径活接头安装在3/8"段的开口端 W与系统的其余部分联系。 阳137] 管用于限制插入件的内部体积，而不是直接制造具有小孔的插入件W简化制造。
[0138] 为了组装反应器，压入玻璃料并且安装的下游插入接头作为规则接头。然后安装 上游插入接头作为规则接头。尽管将其切割得尺寸过小并抛光，但是上游插入接头非常紧 并且难W除去。对于随后的反应器，将图12B中所示的侣垫片用于使反应器具有一致的体 积。垫片将内部体积设定为2mL并且使得能够可重现地组装反应器。此外，垫片有助于在合 成之后除去入口插入接头。垫片防止螺母向下移动并且转动螺母时代替推出的插入接头。 将垂直窗口添加至垫片W维持充足的光进入。组装的大反应器的图片示于图12D中。 阳139] 为了装载反应器，除去入口插入接头，干燥的情况下添加树脂并且用甲醇填充反 应器。然后将入口插入接头连接至热交换器并用甲醇清洗。在不将其从热交换器中除去的 情况下，安装经清洗的入口插入接头，从而引起过量的甲醇通过出口插入接头从反应器排 出。如果存在大的气泡，则将反应器颠倒（入口在出口下面）并清洗。如果运样没有逐出 气泡，则对反应器进行拆卸并重复装载过程。为了在合成之后除去树脂，将用IOmL空气填 充的注射器连接至热交换器入口上的Iuer-Iock快速连接器（其中连接试剂注射器）并用 于递送空气。运样将溶剂从热交换器、反应器和洗涂管线中除去。然后将热交换器和洗涂 管线与反应器断开连接并除去入口插入接头。树脂悬浮于DCM中并且倾析（decant)入烧 结的注射器（Toviq)中，用DCM洗涂四次并且立即切割或者在减压下干燥用于储存。 阳140] 实施例9 阳141] 该实施例描述了用于降低第一代反应器压力的技术。压降固有地由树脂引起。通 过采用高压流动之后的休息时段或者使用大的反应器克服压降。
[0142] 使用低压聚合物反应器，所W设定HPLC累上的过压警报为在24化Si下关掉所述 累，其偶尔被触发。当触发警报时，允许系统休息30秒并且重新启动累而无其他事件。在 该休息阶段期间，树脂明显膨胀。通过观察HPLC累压力，推断如果向珠施加太多的压力，贝U 其开始压紧。运增加了整个床的压降和压紧速率，其快速触发了过压警报。来自Bio-Rad 可用于凝胶渗透色谱法的类似1 %二乙締苯交联的聚苯乙締树脂被推荐仅用于重力驱动分 离，因为其一旦溶胀将非常软。
[0143] 当在运种情况之后立即拆卸反应器时，树脂看起来像实屯、块并且当用移液管尖端 探测时，觉得像硬物质。难W直接将其移液管移出。在几十秒之后，树脂松弛并可W移液 管移出。建造并测试高压不诱钢反应器，但是维持高流动通过压紧床所需的非常高的压力 (>1000 psi)令人联想到之前受困于通过玻璃料挤出树脂的持续流动SPPS。
[0144] 认为最初的压紧发生在玻璃料与树脂的边界处，W使得所述树脂能够在相对小的 变形下机械地封闭一层（course)玻璃料的孔。为了测试运个理论，将最初的40微米玻璃料 用20微米玻璃料代替，并且在更多限制的试验中，用10微米玻璃料和2微米玻璃料代替。 较小的孔没有消除该问题，但是似乎定性地降低了其严重性。由此推断该问题是树脂中固 有的，并且仅可W通过在较低流量下运行或通过降低床的高度（使用较小规模和/或较大 规模的反应器）来消除。
[0145] 已经报道了更硬、更加高度交联的树脂的用途，但是所得的肤具有差的品质。本文 使用的溶液在高压的情况下等待30秒。运是有效的并且有利的，在不进一步最优化反应器 尺寸下允许在合理规模上进展。（实施例8描述的）1/2"ID反应器的试验示出在相同循环 下操作，有达200mg的树脂没有过压。
[0146] 为了克服运些问题，加速合成并增加合成规模，构建实施例8所述的大规模反应 器。 阳147] 实施例10
[0148] 该实施例描述了在六分钟内制备ALFALFA-C0NHNH2。将用于之前实施例的HPLC 累的高容量累压头用于在洗涂步骤期间递送100mL/分钟的DMF，在去保护步骤期间递送100mL/分钟的DMF中的50%赃晚W及在偶联步骤期间递送12ml/分钟的活化氨基酸。反 应器和预热回路通过浸没在水浴中维持在60。C。 阳149] 构建图13所示的仪器。储存器1容纳活化的丙氨酸，储存器2容纳活化的亮氨酸， 储存器3容纳活化的苯丙氨酸，储存器4容纳DMF中的50 %赃晚W及储存器5容纳DMF。 通过将DMF中的50ml0.4M皿TU与20mmolFmoc保护的氨基酸组合来制备每个活化氨基 酸。即将开始运行之前，将IOmL的DIEA添加至每个氨基酸储存器。为了获得期望的流量， 向每个储存器施加1.化ar的氮气压头（nitrogenheadpressure)。累上游的所有管都是 1/8" 0D、1/16"IDPFA。S向阀是Swagelok1/8"S向阀。将S向阀的常规管线引导至转 换阀（ValcoC25-6180)，所述转换阀在试剂之间选择。所有阀都手动控制。所述累是具有 100mL/ 分钟累压头的VarianProstar210。预热回路是 1. 8m的 1/16"0D、0. 030"IDPFA 管。所使用的反应器是图12所示和实施例8所述的较大反应器。所述反应器包含120mg 氯=苯甲基酷阱官能化的聚苯乙締树脂，其是使用本领域普通技术人员已知的标准方法由 商业氯S苯甲基氯化物树脂制备的。使用较大的反应器有助于在100mL/分钟下维持可管 理的压降。
[0150] 如下进行一个合成循环。W12ml/分钟进行第一个20秒偶联。将多点阀设定为 期望的氨基酸并且将=向阀设定为氨基酸。所有其他=向阀设定为DMF。在二十秒之后，所 选择的S向阀从氨基酸转换至DMF并且将累流量设定为100mL/分钟。在五秒之后，将多点 阀转换成赃晚。在另一个五秒之后，所选择的=向阀从DMF转换至赃晚。在10秒之后，所 选择的=向阀被转换回DMF。在五秒之后，将多点阀移动至下一个期望的氨基酸。在另一 个五秒之后，将流量降至12ml/分钟并且所选择的=向阀从DMF转换至下一个期望的氨基 酸，开始下一个循环。每个步骤的总时间如下：20秒偶联、10秒洗涂、10秒去保护和10秒 洗涂。每个循环的总时间是50秒。图14示出了粗材料的LC-MS分析的总离子色谱图。 阳151] 所有上述所列的时间被认为是获得99% +产率所需时间的保守估计。现在已知在 20ml/分钟的流量下，去保护在5秒内结束，并且期望在100mL/分钟下，去保护明显需要小 于5秒。较长的肤（例如常规模型肤ACP化5-74))可例如通过整合另外的3向阀来制备。 预期该实施例中所述的一般策略对于任何肤（包括使用实施例1所述的循环生产的那些） 的产生是可行的。 阳152] 实施例11
[0153] 该实施例描述了改进的合成方案，其中明显减少了合成时间（相对于实施例1)。 该实施例中合成的循环时间小于3分钟。为了减少相对于实施例1的循环时间，调整了洗 涂步骤。累上游的所有管都被1/8"0D1/16"IDPFA代替，并且所述累上游的两个阀被 1/8"SwagelokS向阀代替。除了预热回路，使所有管长度最小化，并且使用实施例8所述 的反应器。所有其他系统的组件相对于实施例1基本上没有改变。除非W下明确指出，否 则所有过程相对于实施例1保持相同。
[0154] 将较大的管和高容量累压头（最大50ml/分钟）用于W20ml/分钟递送DMF和去 保护试剂。基于图11预期的，证实在20ml/分钟下一分钟洗涂在所有情况中是足够的。此 外，5秒去保护步骤被发现在运些流量下是足够的。偶联步骤未改变。根据进行手动步骤 的速度，运样产生的总循环时间为2分钟35秒至约2分钟和50秒。将洗涂设定在20ml/ 分钟下而不是最大的50ml/分钟，因为大多数使用者在较高的流量下难W手动操作所述系 统。预期自动化可用于克服运种人类的限制并且允许用足够大的累实施约10秒/残基的 循环。
[01巧]图15示出了使用该循环制备的肤的两个色谱图。在每个情况中，主峰是期望的产 物。运些是运种长度肤的典型结果。 阳156] 实施例12
[0157] 该实施例更加详细地描述了实施例1至11和实施例13至18所使用的材料W及 实施例1至11所使用的方法。
[0158] 2-(lH-苯并S挫-1-基）-1，1，3,3-四甲基脈鐵六氣憐酸盐（皿TU)、2-(7-氮 杂-IH苯并S挫-1-基）-1,1，3, 3-四甲基脈鐵六氣憐酸盐（HATU)、径基苯并S挫（HOBT) 和Na-Fmoc保护的氨基酸来自Qiem-ImpexInternational,ILNovaBioChem,Darmsta化， 德国和化PtideInstitute,日本。4-甲基二苯甲基胺官能化的交联聚苯乙締（MBHA树脂） 和对-节氧基苄基醇官能化的交联聚苯乙締（Wang树脂）来自Anaspec,CA。N，N-二甲基 甲酯胺值MF)、二氯甲烧（DCM)、二乙酸、甲醇（MeOH)W及HPLC-级乙腊来自VWR，PA。立异 丙基硅烷灯IP巧和1，2乙烧二硫醇来自AlfaAeser，M。S氣乙酸OFA)购自NuGenTec, CA,化Iocarbon,NJ和Sigma-Al化ich，M0。用于LC-MS的溶剂购自TJBaker和Fl址a。所 有的其他试剂购自Sigma-Al化ich，MO。 阳159] 贯穿运些实验中所使用的常规溶剂混合物为：水中的0.1% (v/v)TFA(A)、水中的 0. 1% (v/v)甲酸（A')、乙腊中的0. 1% (v/v)TFA做和乙腊中的0. 1% (v/v)甲酸度'）。[0160]除了图4D中的ACP化5-74)批次，在基于流动的SPPS系统上合成所有肤。除了图 4D和4C中RT的ACP化5-74)批次和ACP化5-74)流，在60°C下合成所有肤，W及在即将使用 之前通过预热回路预热的试剂（参见合成仪设计）。一个合成循环由氨基酸暴露步骤（例 如，酷胺键形成，也称作实施例中的偶联）、氨基酸除去步骤（例如，偶联试剂的除去，也称 作实施例中的洗涂步骤）、去保护剂暴露步骤（例如，NaFmoc除去，也称作实施例中的去保 护）和去保护试剂除去步骤（例如，去保护试剂和反应产物、赃晚-二苯并富締（赃晚-DBF) 的除去，也称作实施例中的洗涂）组成。 阳161] 除非另有说明，否则在实施例1至7中的偶联通过将W下偶联溶液W12ml/分钟 (大约30秒）递送来进行。活化的偶联溶液由溶解于DMF中之5ml0. 4M皿TU和ImLDIEA中的2mmol的Na-Fmoc和侧链保护的氨基酸组成。将半脫氨酸溶解于DMF中之5血0. 4M 皿TU、0. 687血纯DMF和0.313血DIEA中。在运两种情况中，将氨基酸在使用之前溶解在 皿TU溶液中达数小时，并且在使用的两分钟内添加DIEA。体积测量在RT(20°C)下进行。 通过在上述溶液中用HATU代替皿TU来合成图4A中所示的ACP化5-74)。
[0162] 接下来，将偶联溶液用WIOmL/分钟递送超过2分钟的20mL的DMF来除去并且然 后将Na-Fmoc保护基团用W10血/分钟递送超过20秒之3. 3血的DMF中的50 % (v/v)赃 晚来除去。过量的赃晚和赃晚-DBF用WIOml/分钟递送超过2分钟的20mL的DMF来除去 W完成一个循环。 阳163]在IOOmg的1%二乙締苯交联的聚苯乙締树脂上合成所有肤。为了产生C-末端甲 酷胺肤，使用具有载荷为Immol/克的MBHA官能化的树脂，并且偶联的第一个残基是TFA不 稳定化nk连接臂巧inklinker)。为了产生用于连接的C-末端酷阱肤，使用如下官能化的 Wang树脂。载荷为 0. 6mmol/g(0. 06mmol规模）。 阳164] 通过用TFA中之2. 5% (v/v)水和2. 5% (v/v)TIPS处理两个小时从树脂切割不 包含半脫氨酸的甲酯胺肤并且对其侧链去保护。用TFA中之2. 5% (vA〇EDT、2. 5% (v/v) TIPS和1% (v/v)水两个小时从树脂切割包含半脫氨酸的甲酯胺肤并且对其侧链去保护。 用TFA中之5% (vA〇EDT、5% (v/v)TIPS和2. 5% (v/v)水切割酷阱肤两个小时。在所有 情况中，除去树脂并将压缩空气用于蒸发切割溶液W在RT下干燥。用冷的二乙酸洗涂=次 所得的固体，溶解于50%A/50%B(v/v)中并冻干。侧链保护如下：Arg任bf)、TyrUBu)、 Lys度OC)、Asp(01:Bu)、Gln(T;rt)、SerUBu)、His(T;rt)、Asn(T;rt)、T;rp度OC)、Glu(01:Bu)、 T虹（tBu)、切S(Trt)。 阳1佑IWang树脂如下进行官能化：将5. 47gWang树脂添加至500ml的