一种壳寡糖-o-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂及其制备方法
【技术领域】
[0001] 本发明属于食品添加剂技术领域，尤其设及一种壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生 物抗菌剂及其制备方法。
【背景技术】
[0002] 近年来，食品安全问题已成为全球公众优先考虑的世界性焦点问题之一。食品在 生产加工、运输、胆藏和销售等过程中都可能会遭受到一些有害微生物的污染，运些有害微 生物能够污染食品，使食品腐败变质，不仅会造成食品资源的严重浪费，而且还会对误食者 的身体造成严重的伤害，因此各类食品的防腐保鲜始终是一个亟待解决的重要问题。天然 防腐抑菌剂如壳聚糖和曲酸，W其安全无毒、热稳定性好等特性受到人们的亲睐，通过化学 改性开发出具有更强抑菌活性和更广抑菌谱的天然食品防腐剂已经成为人们研究的热点。
[0003] 壳寡糖是壳聚糖主链经物理、化学或酶降解断裂后得到的低分子量碱性氨基寡 糖。具有生物可降解性、生物相容性、生物无毒性和化学反应活性，对包括细菌、真菌在内的 一系列微生物都有抑制作用，被视为开发新型天然食品防腐剂的理想材料。
[0004] 然而，由于壳寡糖为天然大分子产物，当作为食品防腐抗菌剂使用时，与传统的常 用化学防腐剂相比，仍有抗菌活性低等缺点，所W目前在食品工业中的应用并不是很普遍。 因此，可W通过对壳寡糖的结构进行化学修饰，由于其分子链上具有化学反应活性的氨基 和径基，运些位点均是对壳寡糖进行化学改性的理想作用位点，可W进一步提高其抗菌活 性，运也是目前国内外研究较多的有效方法。 阳〇化]有鉴于上述的缺陷，本设计人，积极加W研究创新，W期创设一种壳寡糖-0-曲 酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂及其制备方法，使其更具有产业上的利用价值。
【发明内容】
[0006] 为解决上述技术问题，本发明的目的是提供一种壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生 物抗菌剂及其制备方法，将曲酸中的活性抗菌基团一丫 -化喃酬基和N-甲基赃嗦引入到壳 寡糖分子链中，与壳寡糖分子产生协同作用，W增强壳寡糖的抗菌活性，得到溶解性好、相 互增效的壳寡糖衍生物。
[0007] 本发明提出的一种壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂，其化学结构式如下 所示，其中，n为6-20,取代度为1.21-1.78。
[0008]
[0009] 本发明还提出了壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，包括W下 步骤：
[0010] (1)将壳寡糖希夫碱与氯代曲酸-曼尼希碱用有机溶剂分别溶解后，混合并揽拌， 反应结束后添加有机溶剂沉淀产物，过滤，沉淀产物用有机溶剂索氏抽提，冷冻干燥即得壳 寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物；
[0011] (2)向所述步骤（1)的壳寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物中添加0.25mol/ L的盐酸/乙醇（V/V= 1:4)混合液，混合并揽拌，反应结束后调节抑至中性，用有机溶剂 洗涂，抽滤，冷冻干燥得到样品。
[0012] 进一步的，所述方法还包括在步骤（2)之后的纯化步骤，将所述干燥好的产品透 析，加入有机溶剂沉淀，抽滤，冷冻干燥最终得到经纯化的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生 物。
[0013] 进一步的，所述壳寡糖希夫碱与氯代曲酸-曼尼希碱的质量份比例为2 : (1-5)。
[0014] 进一步的，所述壳寡糖的分子量为1000~5000化，脱乙酷度为90-95%。
[0015] 进一步的，所述步骤（1)中，溶解氯代曲酸-曼尼希碱的有机溶剂为二甲亚讽或二 甲基甲酯胺，用量为氯代曲酸-曼尼希碱质量的2-4倍；溶解壳寡糖希夫碱的有机溶剂为二 甲基甲酯胺和化晚，二甲基甲酯胺的用量为壳寡糖希夫碱的2-4倍，化晚的用量为壳寡糖 希夫碱的2-6倍。
[0016] 进一步的，所述步骤（1)中，反应溫度为-35°C~40°C，反应时间为2~化。
[0017] 进一步的，所述步骤（2)中，反应溫度为室溫，反应时间为12-2地。
[0018] 进一步的，所述步骤（1)中，所述氯代曲酸-曼尼希碱的制备方法包括W下步骤：
[0019] 将N-甲基赃嗦和氯代曲酸溶解在甲醇和福尔马林溶液中，在室溫下快速揽拌，生 成褐色沉淀，收集、过滤，用无水甲醇洗涂若干次，用无水甲醇重结晶、干燥，即得到氯代曲 酸-曼尼希碱。
[0020] 进一步的，所述N-甲基赃嗦和氯代曲酸的质量份比例为1 : (2-3)，所述甲醇和福 尔马林溶液的体积份比例为（10-20) : 1。
[0021] 借由上述方案，本发明至少具有W下优点：本发明基于亚结构连接的思想，把曲酸 中的活性基团一丫 -化喃酬基和N-甲基赃嗦接入到壳寡糖分子链中，使S者具有协同抗菌 活性，开发出新型的食品防腐抑菌剂。
[0022] 上述说明仅是本发明技术方案的概述，为了能够更清楚了解本发明的技术手段， 并可依照说明书的内容予W实施，W下W本发明的较佳实施例并配合附图详细说明如后。
【附图说明】
[0023] 图1是壳寡糖的红外光谱图；
[0024] 图2是本发明实施例一中制备的壳寡糖衍生物的红外光谱图；
[0025] 图3是本发明实施例一中制备的壳寡糖衍生物的Ih-NMR图；
[0026] 图4是本发明实施例一中制备的壳寡糖衍生物的"C-NMR图；
[0027]图5是本发明实施例二中制备的壳寡糖衍生物的红外光谱图；
[0028] 图6是本发明实施例=中制备的壳寡糖衍生物的红外光谱图。
【具体实施方式】
[0029] 下面结合附图和实施例，对本发明的【具体实施方式】作进一步详细描述。W下实施 例用于说明本发明，但不用来限制本发明的范围。
[0030] 具有良好水溶性和抗菌活性的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物的制备方法如 下：采用N-甲基赃嗦和氯代曲酸为原料，首先经曼尼希反应得到氯代曲酸-曼尼希碱，然后 与经氨基保护的壳寡糖希夫碱发生烷基化反应，再经氨基脱保护反应和纯化得到保留活性 氨基的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物，其合成路线如下：
[0033] 壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法包括W下步骤：
[0034] 1、氯代曲酸-曼尼希碱的制备
[0035]N-甲基赃嗦和氯代曲酸按质量比1:2溶解在100血的甲醇和10血的福尔马林溶 液中，在25°C下快速揽拌，生成褐色沉淀，收集、过滤，用无水甲醇洗涂5次，用无水甲醇重 结晶、干燥，即得到氯代曲酸-曼尼希碱。
[0036] 2、壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物的制备
[0037] 快速揽拌下，把0.5g氯代曲酸-曼尼希碱溶于2mL的二甲亚讽中，Ig壳寡糖希夫 碱（分子量为lOOODa，脱乙酷度为90% )溶于2mL的二甲基甲酯胺和2mL的化晚混合液 中，将溶于二甲基甲酯胺和化晚混合液中的壳寡糖希夫碱逐滴加入溶于二甲基甲酯胺的氯 代曲酸-曼尼希碱中，反应混合物在-35°C水浴中磁力揽拌2小时后，倒入过量丙酬使产品 沉淀，沉淀物过滤，沉淀物分别用乙醇、丙酬进行索氏提取W除去二甲基甲酯胺和化晚，冷 冻干燥得即得到Ig壳寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物。
[0038] 在上述制得的壳寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物中添加0. 25mol/L的盐酸 乙醇（V/V= 1:4)混合液20mL，室溫揽拌1化后，用10%的胞2〇)3调节抑至中性，用丙酬 反复洗涂5次，抽滤，冷冻干燥。
[0039] 将1克粗品悬于5血超纯水中，放入透析袋中，透析24小时，浓缩，加入足量的丙 酬沉淀，抽滤，冷冻干燥最终得到经纯化的褐色的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物。
[0040] 该壳寡糖衍生物的得率为62. 1 %，使用红外光谱和核磁共振对其进行表征。
[0041] 图1为壳寡糖的红外光谱图，其中，3422. 36cm1为O-H与N-H的伸缩振动吸收峰， 2923. 83cm1为C-H伸缩振动的吸收峰，1628. 76cm1为NH2的弯曲振动吸收峰，1155. 97cm1 与1071. 52cm 1为C-O伸缩振动的吸收峰，893. 24cm 1为环伸缩振动吸收峰。
[0042] 图2是本实施中壳寡糖衍生物的红外光图谱，其中，890. 44cm1处对应的0-化喃 型糖巧键的特征吸收峰，1519. 37cm1为该衍生物中C=C伸缩振动吸收峰，1223. 02cm1为 该衍生物中C-O-C伸缩振动吸收峰，970. 39cm1为氯代曲酸-曼尼希碱与壳寡糖共价结合 键的吸收峰，1223. 02cm1和970. 39cm1的存在证明目标产物的形成。 阳0创图3是本实施例中壳寡糖衍生物的Ih-NMR图，化学位移出现在1. 968ppm处的峰 对应的是乙酷氨基残基上的-邸3的质子峰；2. 447-2. 79化pm处的峰对应的是氨基葡萄糖 残基和乙酷氨基残基上&的质子峰；3. 089-3. 837ppm处的峰对应的是氨基葡萄糖和乙酷 氨基葡萄糖上相应的H3,H4,册，册处的质子峰；4. 7ppm处的峰为溶剂峰；4. 26和6. 82ppm 处出现了两个新的化学位移，可分别归属为曲酸5-径基化喃酬骨架上-C肥(H-7')和H-3' 各质子的化学位移；而5 =2. 98ppm处的氨基葡萄糖残基上&的化学位移仍然存在，此结 果与红外光谱的结果一致，所W运些新的化学位移证明曲酸中5-径基化喃酬与壳寡糖的 氨基发生了烷基化；2. 88,3. 07和3. 12ppm处为N-甲基赃嗦环上的的化学位移；因此，通过 W上化学位移的归属，可W证明，氯代曲酸-曼尼希碱与壳寡糖希夫碱发生了 0-烷基化反 应，壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物制备成功。 W44] 图4为本实施例中壳寡糖衍生物的"C-NMR图，5 = 22. 74,56. 33,60. 46,71.03， 75. 11，76. 95,98. 63,174.ISppm分别归属为壳寡糖分子中-邸3,C2,C6,C3,C5,C4,Cl和-C=0的化学位移；S= 45. 83,47. 08,56. 38ppm，分别归属为衍生物中N-甲基赃嗦环上 的-C肥和-邸3中的C。5 = 60. 44,114. 64,139. 82,145. 87,159. 35 和 176. 99卵m处的化 学位移归属为衍生物中的5-径基化喃酬基中C-7'，C-3'，C-6'，C-5'，C-2'和C-4'的化 学位移，表明壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物制备成功。 阳045] 实施例二：
[0046] 壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法包括W下步骤：
[0047] 1、氯代曲酸-曼尼希碱的制备 W48]N-甲基赃嗦