和氯代曲酸按质量比1:2. 5溶解在150血的甲醇和10血的福尔马林 溶液中，在25°C下快速揽拌，生成褐色沉淀，收集、过滤，用无水甲醇洗涂5次，用无水甲醇 重结晶、干燥，即得到氯代曲酸-曼尼希碱。 W例 2、壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物的制备
[0050] 快速揽拌下，把1. 5g氯代曲酸-曼尼希碱溶于3mL的二甲基甲酯胺中，Ig壳寡糖 希夫碱（分子量为3000化，脱乙酷度为93%)溶于3mL的二甲基甲酯胺和4血的化晚混合 液中，将溶于二甲基甲酯胺和化晚混合液中的壳寡糖希夫碱逐滴加入溶于二甲基甲酯胺的 氯代曲酸-曼尼希碱中，反应混合物在-5°C水浴中磁力揽拌4小时后，倒入过量丙酬使产品 沉淀，沉淀物过滤，沉淀物分别用乙醇、丙酬进行索氏提取W除去二甲基甲酯胺和化晚，最 后得到经真空冷冻干燥后的产品I. 8g。
[0051] 在上述制得的壳寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物中添加0. 25mol/L的盐酸 乙醇（V/V= 1:4)混合液36mL，室溫揽拌1化后，用10%的胞2〇)3调节抑至中性，用丙酬 反复洗涂5次，抽滤，冷冻干燥。 阳05引将1克粗品悬于5血超纯水中，放入透析袋中，透析24小时，浓缩，加入足量的丙 酬沉淀，抽滤，冷冻干燥最终得到经纯化的褐色的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物。
[0053] 该壳寡糖衍生物的得率为65. 2%。图5为该样品的红外光谱图，其中，892. 24cm1 处对应的0 -化喃型糖巧键的特征吸收峰，1518. 32cm1为该衍生物中C=C伸缩振动吸收 峰，1226. 23cm1为该衍生物中C-O-C伸缩振动吸收峰，971. 91cm1为氯代曲酸-曼尼希碱与 壳寡糖共价结合键的吸收峰，1226. 23cm1和971. 91cm1的存在证明目标产物的形成。 阳054] 实施例S: 阳化5] 壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法包括W下步骤：
[0056] 1、氯代曲酸-曼尼希碱的制备
[0057]N-甲基赃嗦和氯代曲酸按质量比1:3溶解在200血的甲醇和10血的福尔马林溶 液中，在25°C下快速揽拌，生成褐色沉淀，收集、过滤，用无水甲醇洗涂5次，用无水甲醇重 结晶、干燥，即得到氯代曲酸-曼尼希碱。 阳05引 2、壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物的制备
[0059] 快速揽拌下，把2. 5g氯代曲酸-曼尼希碱溶于4血的二甲亚讽中，Ig壳寡糖希夫 碱（分子量为5000化，脱乙酷度为95% )溶于4血的二甲基甲酯胺和6mL的化晚混合液 中，将溶于二甲基甲酯胺和化晚混合液中的壳寡糖希夫碱逐滴加入溶于二甲基甲酯胺的氯 代曲酸-曼尼希碱中，反应混合物在40°C水浴中磁力揽拌6小时后，倒入过量丙酬使产品沉 淀，沉淀物过滤，沉淀物分别用乙醇、丙酬进行索氏提取W除去二甲基甲酯胺和化晚，最后 得到经真空冷冻干燥后的产品3g。
[0060] 在上述制得的壳寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物中添加0. 25mol/L的盐酸 乙醇（V/V= 1:4)混合液60mL，室溫揽拌1化后，用10%的胞2〇)3调节抑至中性，用丙酬 反复洗涂5次，抽滤，冷冻干燥。
[0061] 将1克粗品悬于5mL超纯水中，放入透析袋中，透析24小时，浓缩，加入足量的丙 酬沉淀，抽滤，冷冻干燥最终得到经纯化的褐色的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物。
[0062] 该壳寡糖衍生物的得率为63. 5%。图6为该样品的红外光谱图，其中，893. 34cm1 处对应的0 -化喃型糖巧键的特征吸收峰，1514. 18cm1为该衍生物中C=C伸缩振动吸收 峰，1223. 73cm1为该衍生物中C-O-C伸缩振动吸收峰，970. 39cm1为氯代曲酸与壳寡糖共价 结合键的吸收峰，1223. 13cm1和970. 39cm1的存在证明目标产物的形成。
[006引抗菌性的检测W64] 1、抗菌剂溶液的制备 阳0化]将实施例一、实施例二、实施例=中的样品分别命名为衍生物1、衍生物2、衍生物 3,用去离子水将壳寡糖、曲酸、衍生物1、衍生物2和衍生物3溶解，配成浓度梯度为0. 01、 0. 05、0. 1、0. 5、1. 0、2. 0、3. 0、4. 0、5. 0、6. 0、7. 0、8. 0 和 9.Omg/mL的溶液，用 0. 的微孔 滤膜过滤，备用。
[0066] 2、抗菌活性测定
[0067] 将I血的初始菌液与98血灭菌后的营养肉汤培养混合，再向其中加入I血的不同 浓度梯度的上述抗菌剂，WImL去离子水代替抗菌剂溶液作为空白，37°C下摇床培养。在培 养过程中，化后取出ImL培养液，倍比稀释后涂布平板法计算菌落数，每个样品重复3次。 抗菌率（I)按照W下公式计算：
[0068] !(% ) = N1-N2/N1XIOO 阳069]其中，Nl:初始培养液中的菌落总数；
[0070] N2 :含有抗菌剂培养液中的菌落总数。
[0071] W抗菌剂的浓度为横坐标，抑制率为纵坐标作图，得到ICs。值
[0072] 表1抗菌剂性能的检测
[0074] 从表1中可W看出，本发明制得的抗菌剂对金黄色葡萄球菌、酿脈链球菌、枯草芽 抱杆菌、鼠伤寒沙口氏菌、频疾志贺氏菌和大肠杆菌都具有很好的抗菌活性，而且抗菌性能 大大优于壳寡糖和曲酸，在食品防腐方面具有潜在的应用价值。
[0075] 综上所述，本发明的原理如下：壳寡糖的分子结构中有=个化学改性活性位点，如 果发生烷基化反应，按照=个位置活性的大小，首先发生在C-2位氨基上，其次是C-6位伯 径基上，最后是C-3位仲径基上。由于在酸性溶液中，壳寡糖分子中的C-2氨基质子化之后， 是起抗菌作用的活性基团，因此，首先将C-2位的活性氨基用苯甲醒进行保护，待发生了烧 基化反应之后，再在酸醇溶液中脱保护，释放活性氨基。而C-3位的径基由于位阻效应，不 参与反应。因此C-6位的径基与氯代曲酸-曼尼希碱发生0-烷基化反应。
[0076] 本发明的有益效果如下：（1)通过壳寡糖的C-6位的径基与氯代曲酸-曼尼希碱 发生0-烷基化反应，将曲酸中的活性抗菌基团一丫-化喃酬基和N-甲基赃嗦引入到壳寡 糖分子链中，与壳寡糖分子产生协同作用，显著增强其抗菌活性。（2)此类新的衍生物毒性 低，且有很好的水溶性，可溶解于多种无机和有机溶剂中，避免了有机溶剂的使用，更有利 于环境保护，而且扩大了其应用领域，在医药、食品、化妆品和农业等领域有广泛的应用价 值。
[0077] W上所述仅是本发明的优选实施方式，并不用于限制本发明，应当指出，对于本技 术领域的普通技术人员来说，在不脱离本发明技术原理的前提下，还可W做出若干改进和 变型，运些改进和变型也应视为本发明的保护范围。
【主权项】
1. 一种壳寡糖-O-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂，其特征在于：其化学结构式如下所 示，其中，n为6-20,取代度为1.21-1.78。2. 根据权利要求1所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：包括以下步骤： (1) 将壳寡糖希夫碱与氯代曲酸-曼尼希碱用有机溶剂分别溶解后，混合并搅拌，反应 结束后添加有机溶剂沉淀产物，过滤，沉淀产物用有机溶剂索氏抽提，冷冻干燥即得壳寡糖 希夫碱-〇-曲酸-曼尼希碱衍生物； (2) 向所述步骤（1)的壳寡糖希夫碱-0-曲酸-曼尼希碱衍生物中添加0. 25mol/L的 盐酸/乙醇（V/V= 1:4)混合液，混合并搅拌，反应结束后调节pH至中性，用有机溶剂洗涤， 抽滤，冷冻干燥得到样品。3. 根据权利要求2所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述方法还包括在步骤（2)之后的纯化步骤，将所述干燥好的产品透析，加入有机 溶剂沉淀，抽滤，冷冻干燥最终得到经纯化的壳寡糖-〇-曲酸-曼尼希碱衍生物。4. 根据权利要求2所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述壳寡糖希夫碱与氯代曲酸-曼尼希碱的质量份比例为2 : (1-5)。5. 根据权利要求4所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述壳寡糖的分子量为1000~5000Da，脱乙酰度为90-95%。6. 根据权利要求2所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述步骤（1)中，溶解氯代曲酸-曼尼希碱的有机溶剂为二甲亚砜或二甲基甲酰 胺，用量为氯代曲酸-曼尼希碱质量的2-4倍；溶解壳寡糖希夫碱的有机溶剂为二甲基甲酰 胺和吡啶，二甲基甲酰胺的用量为壳寡糖希夫碱的2-4倍，吡啶的用量为壳寡糖希夫碱的 2-6 倍。7. 根据权利要求2所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述步骤（1)中，反应温度为-35°C~40°C，反应时间为2~6h。8. 根据权利要求2所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述步骤（2)中，反应温度为室温，反应时间为12-24h。9. 根据权利要求2所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述步骤（1)中，所述氯代曲酸-曼尼希碱的制备方法包括以下步骤： 将N-甲基哌嗪和氯代曲酸溶解在甲醇和福尔马林溶液中，在室温下快速搅拌，生成 褐色沉淀，收集、过滤，用无水甲醇洗涤若干次，用无水甲醇重结晶、干燥，即得到氯代曲 酸-曼尼希碱。10. 根据权利要求9所述的壳寡糖-0-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂的制备方法，其特 征在于：所述N-甲基哌嗪和氯代曲酸的质量份比例为I:(2-3)，所述甲醇和福尔马林溶液 的体积份比例为（10-20) :1。
【专利摘要】本发明属于食品添加剂技术领域，尤其涉及一种壳寡糖-O-曲酸-曼尼希碱衍生物抗菌剂及其制备方法，该方法包括以下步骤：(1)将N-甲基哌嗪和氯代曲酸混合并反应，得到产物氯代曲酸-曼尼希碱；(2)将壳寡糖希夫碱与氯代曲酸-曼尼希碱混合并反应，经过后处理得到壳寡糖希夫碱-O-曲酸-曼尼希碱衍生物，经过氨基去保护反应和纯化得到壳寡糖-O-曲酸-曼尼希碱衍生物。本发明将具有抗菌性能的分子引入壳寡糖分子中，与壳寡糖分子产生协同作用，增强了壳寡糖的抗菌活性，制备方法简单、取代度高、成本低、提纯方法简便、性质稳定，得到的壳寡糖衍生物具有良好水溶性和抗菌活性，对大肠杆菌、金色葡萄球菌等均具有很好的抗菌活性，很适合作为抗菌材料。
【IPC分类】A23L3/3562, C08B37/08
【公开号】CN105218700
【申请号】CN201510443851
【发明人】夏文水, 刘晓丽, 姜启兴, 许艳顺, 于沛沛
【申请人】江南大学
【公开日】2016年1月6日
【申请日】2015年7月24日