期来自参照样品的拷贝数是整数，且Kl和K2之间的差可显示出一种感兴趣的样品中的异常。在一些实施方案，通过将特定样品的比例与来自多种样品的平均比例进行比较来检测异常。该方法还预期，对照基因组序列包括每个基因组总长已知的不同部分，其中感兴趣的序列包括每个正常基因的长度已知的不同部分，且其中Kl和K2之间的显著差表明基因组中的遗传异常。在一些实施方案中，感兴趣的核苷酸可与三体连锁的染色体相关，其中对照基因组序列来自除三体连锁的染色体以外的染色体，和其中大约2:3或3:2的K1/K2比例指示三体基因型。在一些实施方案中，感兴趣的核苷酸序列包含一部分基因组的缺失。在一些实施方案中，感兴趣的核苷酸序列包含重复序列。这样，根据本文中的一些实施方案可确定重复序列的拷贝数。在一些实施方案中，第一样品包含母体血液(在没有被任一种理论限制的情况下，其可包括胎儿核酸)，而第二样品包含除血液以外的母体组织(优选为几乎不包含或不可能包含胎儿核酸的组织)。
[0052]在一些实施方案中，进行数字计数检测。在一些实施方案中，对颗粒(如珠)、细菌或病毒体颗粒进行数字计数检测。如本领域技术人员应认识到的，本文中描述的方法可以应用于可被唯一标记的各种靶标。在一些实施方案中，进行数字核型分析。例如，在一些实施方案中，对具有感兴趣的潜在非整倍体的染色体进行数字核型分析。本文中描述的方法可用于检测任何感兴趣的染色体变异，包括易位、添加、扩增、颠换、倒置、非整倍体、多倍体、单体性、三体性、21三体、13三体、14三体、15三体、16三体、18三体、22三体、三倍体性四倍体或性染色体的异常，包括但不限于X0、XXY、XYY和XXX。
[0053]在一些实施方案中，本文提供了方法，其中该方法足够敏感以致可检测在长度上约为几十至几百个核苷酸的“短”片段。在一些实施方案中，本文中描述的样品分子包含多核苷酸“短”片段。例如，在一些实施方案中，多核苷酸片段的长度为约10、15、20、25、30、35、40、45、50、55、60、65、70、75、80、85、90、95或100个核苷酸。在一些实施方案中，多核苷酸片段的长度为约 100、125、150、175、200、225、250、275、300、325、350、375、400、425、450、475、500、525、550、575、600、625、650、675、700、725、750、775、800、825、850、875、900、925、950、975或1000个核苷酸。在一些实施方案中，感兴趣的分子的长度小于约1000、950、900、850、800、750、700、650、600、550、500、450、400、350、300、250、200、150、100 或 50 个核苷酸。在一些实施方案中，片段是双链的。在一些实施方案中，片段包含DNA。在一些实施方案中，片段包含与RNA杂交的DNA。在一些实施方案中，敏感性约高达检测与靶片段有关的单个荧光团。
[0054]在一些实施方案中，感兴趣的核苷酸的长度为至少约500个核苷酸的片段，例如约 500、600、700、800、900、1000、1100、1200、1300、1400、1500、1600、1700、1800、1900 或2000个核苷酸，包括所列值中任意两个之间的范围，例如长度为约500至约2000、约500至约1500、约500至约1000、约500至约900、约500至约700、约700至约2000、约700至约1500、约700至约1000、约700至约900、约1000至约2000、约1000至约1500或约1500至约2000个核苷酸。
[0055]适用于本文中描述的方法和系统的分子包含聚合物、双链DNA、单链DNA、RNA、DNA-RNA杂交体、多肽、生物分子、蛋白质等。适合的聚合物包括均聚物、共聚物、嵌段共聚物、无规共聚物、支链共聚物、树状聚体或其任何组合。
[0056]在一些实施方案中，本文中描述的方法足够敏感以致可检测组成小于母体血液样品中分子总数的约 025%、0.5%,0.75%、1%、1.25%,1.5%,1.75%,2%,2.25%,2.5%,2.75%、3%、3.25%、3.5%、3.75%、4%、4.25%、4.5%、4.75%、5%、6%、7%、8%、9%、10%、11%、12%、13%、14%、15%、20%或 25%的胎儿分子。
[0057]在一些实施方案中，标记针对序列基序或化学部分。标记可使用本领域技术人员已知的任何技术进行，包括化学或生化缀合。在一些实施方案中，本文中描述的标记与独特的序列基序结合。在一些实施方案中，本文中描述的标记与化学部分结合。在一些实施方案中，化学部分与特异性染色体有关。
[0058]在本文的一些实施方案中，各标记独立地选自荧光团、量子点、树状聚体、纳米线、珠、半抗原、链霉亲和素、抗生物素蛋白、中性亲和素、生物素和反应性基团。在本文的一些实施方案中，第一和第二标记独立地选自荧光团或量子点。在本文的一些实施方案中，标记中的至少一种包含非光学标记。在本文的一些实施方案中，用聚合酶进行标记。在本文的一些实施方案中，在包含标记的dNTP的存在下用聚合酶进行标记。在本文的一些实施方案中，聚合酶具有5’至3’核酸外切酶活性。在本文的一些实施方案中，聚合酶离开侧翼区域(flap reg1n),并且其中在用连接酶修复之前，去除侧翼区域以恢复可连接的切口。在本文的一些实施方案中，使用聚合酶的5’至3’核酸外切酶活性在至少一个核苷酸以有限浓度存在的条件下去除侧翼区域。在本文的一些实施方案中，使用聚合酶的5’至3’核酸外切酶活性在至少一个核苷酸从反应中省略的条件下去除侧翼区域。在本文的一些实施方案中，用侧翼核酸内切酶(flap endonuclease)去除侧翼区域。在本文的一些实施方案中，在至少一种dNTP存在的条件下用聚合酶进行标记。在本文的一些实施方案中，至少一种dNTP是单一种类的dNTP。在本文的一些实施方案中，本文描述的方法还包括通过调节温度、dNTP浓度、辅助因子浓度、缓冲液浓度或其任何组合来调节标记期间聚合酶的活性。在本文的一些实施方案中，使第一基序或第二基序产生切口包括用Nt.BspQI产生切口。在本文的一些实施方案中，除本文中描述的序列特异性标记或多种标记之外，还应用了非序列特异性标记例如多核苷酸主链标记。
[0059]在一些实施方案中，本文描述的至少一种标记包括非光学标记。各种非光学标记可与本文的实施方案结合使用。在一些实施方案中，非光学标记包含电子标记。示例性电子标记包括但不限于具有强电荷的分子，例如离子诸如金属离子、带电氨基酸侧链或其它阳离子或阴离子。当将标记置于检测器中时，可例如通过导电性(或电阻率)来检测电子标记。在一些实施方案中，纳米通道包含电极，该电极被配置来通过测定通道中设置的物质的导电性或电阻率来确定电子标记是否存在。在一些实施方案中，非光学标记包含金属、金属氧化物(例如金属氧化物)或氧化硅部分。在一些实施方案中，非光学标记包含含金属、金属氧化物或其它氧化物的部分(例如纳米颗粒)。可以例如通过核磁共振检测特定金属或氧化物部分的存在。在一些实施方案中，标记被配置为根据特定条件(例如，PH变化)释放部分，例如质子或阴离子，并检测释放的部分是存在还是不存在。
[0060]在一些实施方案中，两种或多种标记互不相同。例如，可以用第一标记标记第一基序以产生第一唯一模式，并且可以用与第一标记不同的第二标记标记与第一基序不同的第二基序，以产生第二唯一模式。在一些实施方案中，两种或多种标记是相同的。例如，可以用标记标记第一基序，并且也可以用相同标记标记与第一基序不同的第二基序以产生唯一模式。在一些实施方案中，用第一标记标记与感兴趣的第一染色体或区域对应的多个探针，并且用与第一标记不同的第二标记标记与感兴趣的染色体或区域(例如参照染色体或区域)对应的多个第二探针。这样，可以基于是否用第一标记或第二标记标记样品分子将包含来自感兴趣的第一染色体或区域的序列的标记的样品分子与包含来自感兴趣的第二染色体或区域的序列的样品分子区分开。
[0061]具有可逆终止子的核苷酸能形成第一磷酸二酯键，但在终止子逆转之前，不能形成(或具有有限能力以形成)第二磷酸二酯键。因此，具有可逆终止子的核苷酸可并入多核苷酸(例如在切口位点)，但直到终止子逆转，该核苷酸才可形成下游磷酸二酯键。可以使用本领域技术人员已知的技术进行逆转。例如，可通过能被切割的可切割连接子，例如通过电磁辐射，将终止子连接至核苷酸。如果使用包含3’可逆终止子的标记核苷酸进行切口修复，可将单个标记的核苷酸并入切口，但终止子可防止其它标记的核苷酸并入切口。因此，可将切口标记限于每一切口一个标记的核苷酸。将切口标记限制为每一切口一个标记部分，能使被并入相同切口的多种标记的潜在偏差最小化。例如，如果采取方法将标记限制为每一切口一个标记部分，基于来自标记的相对强信号可解析非常接近的两个切口(即可以消除两种标记简单并入相同切口的可能性)。例如，如果需要定量评价切口数量，每一切口一个标记的方法可促进标记信号强度和切口数量之间的直接相关性。在含有可逆终止子的核苷酸上的标记可如本文中所述。在一些实施方案中，包含可逆终止子的核苷酸包含量子点。在一些实施方案中，包含可逆终止子的核苷酸包含荧光团。在一些实施方案中，包含可逆终止子的核苷酸包含非光学标记。
[0062]在一些实施方案中，多种标记标记单一样品分子。在一些实施方案中，至少一种标记包含序列特异性标记。在一些实施方案中，至少一种标记包含非序列特异性标记。在一些实施方案中，至少一种标记包含序列特异性标记，并且至少一种标记包含非序列特异性标记。在一些实施方案中，至少一种标记不切割DNA的单链或双链。例如，在一些实施方案中，至少一种标记选自非切割限制酶、甲基转移酶、锌指蛋白、抗体、转录因子、DNA结合蛋白、发夹聚酰胺(hairpin polyamide)、形成三股螺旋的寡脱氧核苷酸、肽核酸或其组合。在一些实施方案中，序列特异性或非序列特异性标记都不切割DNA。
[0063]在一些实施方案中，例如如果提供了荧光标记，使用敏感性照相机检测标记的进行。在一些实施方案中，例如如果提供了非光学标记，电子检测标记的进行。然而，可使用适用于对应标记的任一种检测方法。本文中描述的方法可包括在本文描述的分子的一个或多个区域中与荧光标记、放射性标记、磁性标记或其任何组合结合。可在标记与分子或分子的至少一部分或其它感兴趣的区域特异性互补的情况下完成结合。
[0064]在一些实施方案中，切口酶产生随后使用例如标记的核苷酸或核核苷酸类似物标记的序列特异性切口。在一些实施方案中，荧光标记核苷酸或类似物。在一些实施方案中，通过在纳米通道中的限制使DNA线性化，从而导致均匀的线性化并允许严格且精确地测量DNA分子上包含特征模式(signature pattern)的切口标记之间的距离。在一些实施方案中，使用第二切口酶。在一些实施方案中，与第二标记色一起使用该第二切口酶。可根据本文中的实施方案使用的示例性切口酶包括但不限于Nb.BbvCI, Nb.BsmI, Nb.BsrDI,Nb.Bts1、Nt.Alwl、Nt.BbvC1、Nt.BspQ1、Nt.BstNBK Nt.CviPII 及其组合。美国专利申请公开号2011/0171634和美国专利申请公开号2012/0237936中还提供了切口剂和实验规程的实例，上述专利申请的全部内容通过引用并入本文。
[0065]在一些实施方案中，通过将探针与单链多核苷酸杂交，标记多核苷酸例如RNA或DNA。该探针可以与RNA或DNA的单链或其部分互补。在一些实施方案中，探针与特定序列基序互补。在一些实施方案中，提供多种探针以与多种特异性序列基序互补，例如至少2、3、4、5、6、7、8、9、10、20、30、40、50、60、70、80、90、100、200、300、400、500、600、700、800、900、