用于核酸提取的组合物和方法
【专利说明】用于核酸提取的组合物和方法
[0001] 背景 从细胞来源材料、特别是石蜡包埋的组织样品（例如，福尔马林固定的石蜡包埋的样 品：FFPE)提取核酸的现有技术方法涉及复杂的多步骤过程。
[0002] 从痰液中的分枝杆菌提取核酸，例如，是一个挑战，因为痰液是非常粘稠的， 且不容易处理用于核酸提取。痰液样品通常使用N-乙酰基-L-半胱氨酸-氢氧化钠 (NALC-NaOH)处理(CoulterandCharache,Sputumdigestion/decontaminationfor Mycobacteriologyculture-Guidelines,SMILE,JohnHopkinsUniversity, 2008) 溶解，且分枝杆菌通过离心沉淀。NALC-NaOH处理不杀灭分枝杆菌，且进行通过热和/或化 学品的进一步处理来灭活样品。可以使用几种裂解细胞的技术从细胞沉淀提取核酸。超 声处理（Colin,等人，Methodandapparatusforultrasoniclysisofbiological cells,美国专利号 6, 686, 195，2004)、珠击（Melendes,等人，Celldisrupting apparatus,美国专利号 5,464,773，1995)J.(Salazai^PAsenjo，Enzymaticlysisof microbialcells,BiotechnolLett(2007) 29:985-994)、混合（祸旋）、机械剪切和离 液溶液（Das,等人，Methodfordetectingpathologenicmycobacteriainclinical specimens，美国专利号7, 638, 309，2009)是一些用于打破沉淀细胞用于核酸提取的方 法。这些步骤是除了实际提取程序之外的，且为整个过程添加复杂性和时间。
[0003] 从酵母提取核酸也是核酸（例如，DNA)样品制备中更有挑战性的技术之一。酵 母是真菌，且具有难以裂解的细胞壁（Lipke和Ovalle,Cellwallarchitecturein yeast:newstructureandnewchallenges,JBacteriol1998, 180 (15) : 3735) 〇 使用 现有技术的离液盐和去污剂或碱裂解方案的裂解缓冲液在直接裂解酵母细胞中不是非常 有效，但用额外步骤使用。这些额外的步骤可以分为两个主要组：物理方法和酶促方法。物 理方法可以包括细胞的超声处理（专利号6, 686, 195)，有或没有存在研磨颗粒、用研磨颗 粒的高功率搅拌（美国专利号5, 464, 773)(珠击、球磨机），或使用高压力机械剪切（例如， French压力细胞压机，如本领域已知）。酶促方法依赖于特定酶，诸如消解酶（Salazarand Asenjo,同上；美国专利号5, 688, 644)，以削弱细胞壁，使得细胞可以通过更多常规技术来 裂解。
[0004] 从FFPE材料提取、富集和分离核酸是非常复杂的过程，其需要用有机溶剂将组织 脱石蜡，用蛋白酶消化组织，然后从组织提取核酸。这些现有技术方法使用多种溶液和多个 步骤。所用有机溶剂通常不与水溶液混溶。
[0005] 因此，需要的是允许从细胞来源材料、特别是分枝杆菌、酵母和FFPE样品有效提 取、富集、分离和纯化核酸的组合物和方法。
[0006] 发明概述 本发明通过提供用于从细胞来源材料（包括细菌、酵母和福尔马林固定石蜡包埋 (FFPE)组织）提取核酸的一步方法解决核酸提取的现有技术问题。在一个实施方案中，本 发明包括能够在一个步骤中裂解细胞和纯化核酸的含水提取溶液。
[0007] 本发明涉及允许从包括FFPE组织的样品直接提取核酸的核酸提取方法。该方法 利用极性和非极性有机溶剂以及离液剂和去污剂的组合，以增溶石蜡、分解组织且释放核 酸。核酸然后可以，例如，捕获在单一溶液中的含有二氧化硅的颗粒上。捕获颗粒，如果使 用，可以是磁性的。该方法中没有分开的脱石蜡步骤或蛋白酶消化。所述有机溶剂是完全混 溶的，且在该方法中没有相分离。提取方法使用胺单体诸如2, 2' ·（亚乙基二氧基）二（乙 胺）组合含有离液剂诸如尿素或硫氰酸胍和去污剂的水溶液。提取方法还可以任选地含有 其他有机溶剂，诸如二甲亚砜（DMSO)、各种醇类和柠檬烯。该过程是极端简单的。样品（例 如，FFPE组织样品）与含有胺单体（例如，2,2'-亚乙基二氧基）二（乙胺）（EDBE)、l，3-二 氨基丙烷（DAP)、2_氨基-1-丁醇（AB)、2-(2_氨基乙氧基）乙醇（AEE)、2_氨基-6-甲基 庚烷（AMH)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、氨基-2-丙醇（A2P)、1，5-二氨基-2-甲基戊 烷（DMP)和3-氨基-1-丙醇（3A1P)中的一种或多种）的提取缓冲液混合。该混合物可以 任选地升温或加热以帮助释放核酸。所述核酸可以捕获微粒上（或本领域普通技术人员已 知的其他合适的固体基质）。例如，二氧化硅涂覆的磁性颗粒可以添加至混合物，且核酸捕 获在颗粒上。本领域普通技术人员已知的捕获核酸的其他方法也适用于本发明。不需要添 加额外的溶液，且不存在脱石蜡步骤或蛋白酶消化。洗涤（或另外处理）颗粒以去除任何 杂质，且用水或稀缓冲溶液从二氧化硅颗粒释放核酸。
[0008] 关于从其他细胞来源样品（诸如，但不限于，分枝杆菌和酵母）浓缩、提取、分离和 纯化核酸，上文概述的方法和组合物也是合适的。
[0009] 本发明的一个优点是，不像现有技术方法，从受试样品提取核酸不需要使用酶用 于裂解细胞材料。
[0010] 本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材 料和ii)包含一种或多种胺单体的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液 接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明还考虑胺单体是伯胺单体。本发明进一 步考虑，所述胺单体是2, 2' -亚乙基二氧基）二（乙胺）（EDBE)、1，3-二氨基丙烷（DAP)、 2-氨基丁醇（AB)、2-(2-氨基乙氧基）乙醇（AEE)、2-氨基-6-甲基庚烧（AMH)、2-氨 基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、氨基-2-丙醇（A2P)、1，5-二氨基-2-甲基戊烷（DMP)和3-氨 基-1-丙醇（3A1P)中的一种或多种。进一步考虑，含水提取溶液可以包含离液剂，且所述 离液剂选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇中的一种或多种。进一步考虑，所述含水提取 溶液可以包含去污剂和醇中的一种或多种，且所述去污剂可以选自Tween?、聚山梨醇酯、脱 氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton?X-100中的一种或多种。 此外，所述去污剂的最终浓度可以为约1 %至15%、约8%至约15%或约10%。进一步考虑 所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的最终浓度为约10 %至约40 %或约20 至约35%。
[0011] 考虑所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约15%至约50%或约20%至约 45%。进一步考虑所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4M至约5M。
[0012] 本发明考虑所述来源材料可以选自活细胞来源材料和固定细胞来源材料。此外， 考虑所述活细胞来源材料可以包含细胞的悬浮液，并且在一些实施方案中，单一的悬浮液 包含细菌。所述细菌可以包含分枝杆菌。在其他实施方案中，细胞的悬浮液可以包含酵母。
[0013] 进一步考虑，本发明的含水提取溶液可以不含酶，且，进一步，可以不含蛋白酶。
[0014] 进一步考虑，所述含水提取溶液优选具有约10至约13的pH和更优选约12至约 13 的pH。
[0015] 进一步考虑，固定细胞来源材料可以包含福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)材料。
[0016] 本发明考虑适于从细胞来源材料提取核酸的含水提取溶液，所述组合物包含一 种或多种胺单体；一种或多种离液试剂，一种或多种去污剂和一种或多种有机溶剂。进一 步考虑，所述胺单体是伯胺单体，且氨基单体可以选自2,2'_亚乙基二氧基）二（乙胺） (EDBE)、1，3-二氨基丙烷（DAP)、2-氨基-1-丁醇（AB)、2-(2-氨基乙氧基）乙醇（AEE)、 2-氨基-6-甲基庚烷（AMH)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、氨基-2-丙醇（A2P)、1，5-二 氨基-2-甲基戊烷（DMP)和3-氨基-1-丙醇（3A1P)中的一种或多种。进一步考虑所述含 水提取溶液中的胺单体的浓度为约15%至约50%或约20%至约45%。进一步，可以考虑 所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇中的一种或多种。进一步考虑所述含 水提取溶液中的离液剂的浓度为约4M至约5M。进一步考虑，所述去污剂可以选自Tween?、 聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton?X-100中 的一种或多种，且最终浓度可为约1 %至15%，约8%至约15%或约10%。进一步考虑，所 述醇可以选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的最终浓度可为约10%至约40%或 约20至约35%。
[0017] 本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材 料和ii)包含氢氧化铵的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致 细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含一种或 多种离液剂。本发明进一步考虑，离液剂可以选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇中的一 种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。 本发明进一步考虑，所述去污剂选自Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二 烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton?X-100中的一种或多种，且所述去污剂的浓度为约1 % 至15%，约8%至约15%或约10%。本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种 或多种，且所述醇的浓度为约10%至约40%或约20至约35%。本发明进一步考虑，所述含 水提取溶液中的离液剂的浓度为约4M至约5M。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自 活细胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细 胞的悬浮液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是 分枝杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取 溶液进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发 明进一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)材料。
[0018] 本发明考虑从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括：提供i)细胞来源材 料和ii)包含脲和硫氰酸胍（GITC)中的一种或多种的含水提取溶液；使所述细胞来源材 料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述含 水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自 Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton? X-100中的一种或多种，且所述去污剂的浓度为约1 %至15%，约8%至约15%或约10%。 本发明进一步考虑，所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种，且所述醇的浓度为约10%至 约40 %或约20至约35 %。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的脲和硫氰酸胍（GITC) 中的一种或多种的总浓度为约4M至约5M。本发明进一步考虑，所述细胞来源材料选自活细 胞来源材料和固定细胞来源材料。本发明进一步考虑，所述活细胞来源材料包含单细胞的 悬浮液。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含细菌。本发明进一步考虑，所述细菌是分枝 杆菌。本发明进一步考虑，细胞的悬浮液包含酵母。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液 进一步是无酶的。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无蛋白酶的。本发明进 一步考虑，固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)材料。本发明的含水提取 溶液，本实施方案也可以包含15 %至约50 %或约20 %至约45 %的浓度的胺单体。
[0019] 本发明考虑灭活和杀灭分枝杆菌的方法，所述方法包括：提供i)包含分枝杆菌 的细胞来源材料和ii)包含一种或多种胺单体的含水提取溶液；使所述细胞来源材料与所 述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。本发明进一步考虑，所述胺单体是伯 胺单体。本发明进一步考虑，所述胺单体是2, 2' -(亚乙基二氧基）二（乙胺）（EDBE)。本 发明进一步考虑，所述胺单体是1，3-二氨基丙烷。本发明进一步考虑，所述胺单体是3-氨 基 _1_丙醇。本发明进一步考虑，所述胺单体是2-氨基-1-丁醇（AB)、2-(2-氨基乙氧基） 乙醇（AEE)、2-氨基-6-甲基庚烷（AMH)、2-氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、氨基-2-丙醇 (A2P)或1，5-二氨基-2-甲基戊烷（DMP)。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步 包含离液剂。本发明进一步考虑，所述离液剂可以选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇中 的一种或多种。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或 多种。本发明进一步考虑，所述去污剂选自Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠 和十二烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton?X-100中的一种或多种。本发明进一步考虑， 所述去污剂的浓度可为约1 %至15%、约8%至约15%或约10%。本发明进一步考虑，所述 醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。本发明进一步考虑，所述醇的浓度为约10%至约40% 或约20至约35%。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约15%至 约50 %或约20 %至约45 %。本发明进一步考虑，所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约 4M至约5M。本发明进一步考虑，包含分枝杆菌的来源材料包含单细胞的悬浮液。本发明进 一步考虑，所述含水提取溶液进一步是无酶的。本发