[0058] 在本发明的涉及固定组织的一个实施方案中，本文所述的单一步骤方法，无需对 材料单独脱石蜡或酶促消化材料以释放DNA。在某些实施方案中，将DNA捕获在固体支持物 (例如，含有二氧化硅的表面）上，而无需对材料脱石蜡或酶促消化材料以释放DNA。在本发 明的涉及固定组织的实施方案中，本文所述的单一步骤方法，无需其他裂解方法或酶促消 化材料。在某些实施方案中，将DNA捕获在固体支持物（例如，含有二氧化硅的表面）上，而 无需裂解样品以便从细胞来源材料释放DNA。在某些实施方案中，将酵母DNA捕获在固体支 持物（例如，含有二氧化硅的表面）上，而无需裂解样品以便从细胞来源材料释放DNA。在 本发明的涉及细菌细胞来源材料的实施方案中，本文所述的单一步骤方法无需其他裂解方 法或酶促消化材料。在某些实施方案中，DNA从所述材料释放且富集或纯化，而无需灭活细 菌。在某些其他实施方案中，将DNA捕获在固体支持物（例如，含有二氧化硅的表面）上， 而无需裂解样品或酶促消化材料以便从细胞来源材料释放DNA。
[0059] 本发明不限于用于细胞来源材料的任何特定来源源。细胞来源材料可以获得自任 何类型的含有核酸的细胞或组织。这包括病毒和含有病毒的细胞，细菌（例如，分枝杆菌属 中的一种或多种，例如，结核分枝杆菌）和含有细菌的细胞，其他所有原核细胞，酵母（例 如，酵母属细胞或念珠菌属中的一种或多种，例如，白色念珠菌），所有其他真菌，植物（即 植物）和动物细胞等。细胞来源材料可以最近获得且是活的或可以不是活的。同样，细胞 来源材料可以是经由本领域普通技术人员已知的保存和固定化合物和技术（其简述可见 下文）来保存。福尔马林固定、石蜡包埋（FFPE)组织特别适用于本发明。本发明的方法和 组合物裂解分枝杆菌和其他致病生物体，由此杀灭它们，且减轻或消除来自样品的污染的 危险。
[0060] 本发明不需要任何预处理或预操作新鲜（即非固定）细胞来源材料。进一步，如 果使用预处理或预操作程序，则本发明不限于任何特定预处理或预提取操作程序。然而， 在一些情况下，预处理或预提取细胞来源材料可以是有利的。例如，可期望通过离心浓缩 悬浮细胞。此外，大组织（新鲜、固定固定且包埋），如果处理（例如，切割或研磨）成较小 切片，则更容易处理。适合于预处理样品的方法是本领域已知的，且包括，但不限于，在有或 没有存在研磨颗粒的情况下细胞的超声处理（专利号6, 686, 195)，混合（例如，涡旋），用 研磨颗粒的高功率搅拌（美国专利号5, 464, 773)(珠击、球磨机），或使用高压力机械剪切 (例如，French压力细胞压机，如本领域已知）。进一步，酶促方法使用特定酶，诸如消解酶 (SalazarandAsenjo,同上；美国专利号5, 688, 644)，以削弱细胞壁。又进一步，如果革巴向 特定细胞类型，则可以优选从较大群体分离该特定细胞类型。然而，这些程序被表明易于操 作和方便性，且不是因为本发明需要预处理或预操作。
[0061]在本发明的一个实施方案中，本发明使用包含一种或多种胺单体的提取溶液（组 合物）。尽管本发明不限于任何具体理论，在本发明的上下文中，据信具有一种或多种胺单 体的试剂作为溶剂发挥功能。包含一种或多种胺单体的试剂的实例是，例如，包括2, 2' -亚 乙基二氧基）二（乙胺）：C6H16N202) (EDBE)。EDBE是伯胺单体。进一步，本发明不限于任 何特定胺单体或伯胺单体。例如，伯胺单体二氨基丙烷（例如，1，2-二氨基丙烷和1，3-二 氨基丙烷）也可用于本发明中，如下面所例举。进一步，3-氨基-1-丙醇（3A1P)可用于本 发明中，如下面所例举，且表现出比上面命名的其他两种胺单体更低的毒性。本发明的提取 溶液中的胺单体的最终浓度是约15%至约50%或约20%至约45%或约40%。初步结果表 明，氢氧化铵（ΝΗ40Η)作为胺单体的替代物是有效的，尽管具有降低的有效性。
[0062] 关于本发明，"伯胺"被定义为其中氨分子中仅一个氢原子已经被替代的胺。这意 味着，伯胺的式将是rnh2。仲胺被定义为其中氨分子中两个氢原子已经被替代的胺。这意 味着，伯胺的式将是RNHR。"叔胺"被定义为其中氨分子中三个氢原子已经被替代的胺。"胺 单体"是具有一个或多个胺基团的化合物。
[0063] 在其他实施方案中，考虑试剂的组合可用于本发明的具有合适结果的含水提取溶 液中。例如，上面讨论的胺单体（2, 2' -亚乙基二氧基）二（乙胺）（EDBE)、1，3-二氨基丙烷 (DAP)、2-氨基-1- 丁醇（AB)、2- (2-氨基乙氧基）乙醇（AEE)、2-氨基-6-甲基庚烷（AMH)、 2_氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、氨基-2-丙醇（A2P)、1，5-二氨基-2-甲基戊烷（DMP)和 3_氨基-1-丙醇（3A1P)中的一种或多种）可以与脲和/或GITC和/或ΝΗ40Η使用。本领 域普通技术人员能够仅用常规实验确定可接受的浓度和条件。
[0064] 在另一个实施方案中，考虑本发明的含水提取溶液可以包含尿素和/或GITC，而 不添加胺单体。再次，本领域普通技术人员将能够仅用常规实验确定可接受的浓度和条件。
[0065] 本发明的提取溶液（组合物）也可以任选地包含其他有机溶剂诸如，例如，二甲亚 砜（DMS0)、醇类和柠檬烯。本发明的提取组合物中的有机溶剂的最终浓度，如果存在，为约 10%至30%，约15%至约25%或约20%。
[0066] 本发明的提取溶液（组合物）也可以包含离液剂，诸如，例如，尿素、硫氰酸胍 (GITC)、乙醇或丁醇。其他是本领域技术人员已知的。离液剂是破坏大分子诸如蛋白的结 构和变性大分子诸如蛋白的物质。离液剂通过干扰非共价力诸如氢键介导的分子间相互作 用而发挥作用。本发明的提取组合物中的离液剂的最终浓度为约3.0Μ至约6.0M、约4.0 Μ至约5. 0Μ或约4. 7Μ。
[0067] 进一步，本发明的提取溶液（组合物）包含一种或多种去污剂。去污剂的特征在于 亲水性头部和疏水性尾部。去污剂通常用于细胞和组织工作中。非离子去污剂是优选的。 适用于本发明中的去污剂包括，但不限于，Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和 十二烷基硫酸钠（305)、陬-40和1^行〇111￥父-100(5丨81^41办丨(*，3七1^11丨8，]\?))。本 发明的提取组合物中的去污剂的最终浓度是约1%至15%、约8%至约15%或约10%。尽 管本发明不受理论限制，通常认为，中等浓度的轻度（即非离子）去污剂损害细胞膜的完整 性，由此促进细胞的裂解和可溶性组分的提取。
[0068] 本发明的裂解溶液的pH为高于约7。本发明的裂解溶液的pH可以为高达约pH10 -13或12 - 13。可以通过选择本发明的提取组合物的组分或通过使用缓冲剂来调节和 维持pH。使用缓冲剂是本领域普通技术人员众所周知的。示例性缓冲剂是Tris-HCL。
[0069] 进一步，不像现有技术方法，可以进行本方法，而不使用酶（例如，蛋白酶），用于 降解，例如，组织，尽管酶的使用不是禁忌的。
[0070] 该混合物可以任选地升温或加热以帮助释放核酸。使用的温度的范围可以是约 70°C至约90°C和约80°C至约90°C和约85°C的温度。
[0071] 本发明适用于固定的细胞和组织。固定剂和固定程序的非限制性实例包括，例如， 交联固定剂（例如，醛类，诸如戊二醛、甲醛（福尔马林），等）。交联固定剂通过在组织中 的蛋白之间生成共价化学键而发挥作用。这些交联固定剂，尤其是甲醛，趋于保持蛋白的二 级结构，并且同样可以保护重要的三级结构。沉淀（或变性）固定剂诸如甲醇、乙醇、乙酸 和丙酮也是已知的。
[0072] 氧化固定剂可以与蛋白和其他生物分子的各种侧链反应，允许形成稳定组织结构 的交联。四氧化锇、重铬酸钾、铬酸和高锰酸钾所有都可用于某些特定组织学制备物中。
[0073]Hepes-谷氨酸缓冲剂介导的有机溶剂保护作用（HOPE)给出福尔马林样形态，优 异保持蛋白抗原的免疫组织化学和酶组织化学，良好的RNA和DNA产量且缺乏蛋白交联。
[0074] 通常包埋固定细胞来源材料样品，诸如组织和细胞样品以保持所有结构且为进一 步处理提供支持。传统上，此类样品已经包埋于石蜡中。固定细胞来源材料样品通常固定 于，例如，福尔马林中，然后石蜡包埋，生成福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)的样品。用于固 定细胞和组织和包埋细胞和组织的程序是本领域普通技术人员已知的（例如，参见Leeson 和Leeson,Histology, 1981,ff.B.SaundersCo. ,pages6-8andontheWorld WideWebaten.wikipedia.org/wiki/Histology#Embedding)〇 在现有技术中，已经仅通 过使用困难、多步、耗时的程序完成从FFPE细胞来源材料提取核酸。本发明的组合物和程 序涉及简化、有效的程序。
[0075] 本发明涉及新的且非显而易见的方法，其无需组织的脱石蜡和蛋白酶消化步骤， 用于核酸的提取、浓缩、分离和/或纯化。单一水基溶液用于提取核酸且使核酸结合至固体 基质（如果期望结合）。溶液中含有的有机溶剂是完全混溶的，而无需相分离有机溶剂。通 过本领域普通技术人员已知的任何其他方法，FFPE组织与溶液混合，破坏组织，释放核酸， 且将核酸捕获于，例如，固体基质诸如含有二氧化硅的固体基质上或者从溶液去除。所述基 质可以是颗粒，且可以是磁性颗粒。核酸捕获于固体基质上之后，所述方法使用简单的洗涤 步骤，且从基质洗脱核酸，用于最终纯化或使用。如果需要，可以通过本领域普通技术人员 已知的方法，进一步纯化提取的核酸。
[0076] 可以通过本领域普通技术人员已知的任何程序使用提取的核酸。此类使用的实例 包括杂交测定（northern印迹、Southern印迹，等）、扩增测定（参见，例如，美国专利申请 号4, 683, 195)、测序、复制、并入表达载体或任何有用组合。进一步，本发明的组合物和方法 适合于先前用于FISH(荧光原位杂交）分析或其中不破坏核酸的其他方案的样品。
[0077] 本说明书中提到的所有引文（专利、专利申请出版物、期刊文章、教科书和其它出 版物）表明本公开涉及的本领域技术人员的技术水平。所有此类出版物通过引用并入本 文，其程度等同于每个单独出版物被具体且单独地通过引用并入。
[0078] 本文说明性描述的本发明可以在本文未具体公开的任何要素或限制不存在的情 况下合适地实施。因此，例如，本文中的术语"包含"、"基本上由...组成"和"由......组 成"中任一个的每种情况可以用其他两个术语中的任一个替代。同样地，单数形式"一个/ 种（a) "，"一个/种（an)"和"该（the)"包括复数对象，除非上下文另有明确说明。因此， 例如，提及"方法"包括本文描述和/或在阅读本公开内容之后对于本领域技术人员变得显 而易见的该类型的一种或多种方法和/或步骤。
[0079]在单一步骤中从细朐来源材料提取核酸的实施方案 在一个实施方案中，本发明涉及从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括使细 胞来源材料与能够在单一步骤中裂解细胞材料和提取核酸的含水提取溶液接触。在一个实 施方案中，所述含水提取溶液包含选自一种或多种胺单体和一种或多种酰胺的含氮溶剂。 在一个实施方案中，所述含水提取溶液包含胺单体和酰胺。在另一个实施方案中，所述含水 提取溶液包含伯胺单体。在一个实施方案中，所述胺单体是2, 2' -(亚乙基二氧基）二（乙 胺）（EDBE)。在一个实施方案中，所述胺单体是1，3-二氨基丙烷。在一个实施方案中，所 述胺单体是3-氨基-1-丙醇。在一个实施方案中，同时使用两种或更多种胺单体。在一 个实施方案中，所述胺单体选自2, 2'-亚乙基二氧基）二（乙胺）（EDBE)、1，3-二氨基丙烷 (DAP)、2-氨基-1- 丁醇（AB)、2- (2-氨基乙氧基）乙醇（AEE)、2-氨基-6-甲基庚烷（AMH)、 2_氨基-2-甲基-1-丙醇（AMP)、氨基-2-丙醇（A2P)、1，5-二氨基-2-甲基戊烷（DMP)和 3_氨基-1-丙醇（3A1P)中的一种或多种。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单 体的浓度是约15%至约50%。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是 约20 %至约45%。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的胺单体的浓度是约45 %至 约50%。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包括离液剂。在一个实施方案中，所 述离液剂选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中 的离液剂为约4M至约5M。在一个实施方案中，所述含水提取溶液中的离液剂为约4. 5M至 约5M。在一个实施方案中，所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多种。合 适的去污剂包括Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS)、 NP-40和Triton?X-100。合适的醇包括乙醇、丁醇。在一个实施方案中，所述去污剂的浓 度为约1 %至约15 %或约8 %至约15%。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约10% 至约15%。在一个实施方案中，所述去污剂的浓度为约12%至约15%。在一个实施方案 中，所述醇的浓度为约15%至约25%。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约10%至约 40%。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约20%至约35%。在一个实施方案中，所述醇 的浓度为约20%至约25%。在一个实施方案中，所述醇的浓度为约23%至约25%。在另 一个实施方案中，所述细胞来源材料选自组织、动物组织、哺乳动物组织、人组织、人肿瘤组 织、含有病毒的人组织、固定人组织、动物细胞、哺乳动物细胞、人细胞、含有病毒、细菌、分 枝杆菌、真菌、酵母的人细胞和植物组织或植物细胞、含有细胞的血液、含有细胞的痰液。
[0080] 在单一步骤中从固宙组织细菌来源材料提取核酸的实施方案 在一个实施方案中，本发明涉及从固定组织细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法 包括使细胞来源材料