于本发明 的方法（3A1P提取）的本实验的裂解条件如下。裂解条件：60%裂解缓冲液（LB) ;20%乙醇 和20% 3A1P，总体积1. 5ml。在78°C和94°C且持续30分钟至4小时的时间段测试孵育。 裂解孵育之后，将MMP(25μ1)添加至样品。捕获时间为在室温（RT)下10分钟。MMP在 室温用0.5mlLB和33%EtOH洗涤一次持续2分钟，随后在室温用70%EtOH洗涤两次，每 次2分钟。将样品干燥5分钟，且在70°C用100μ1DI水洗脱10分钟。根据制造商的说明 处理用Qiagen和Promega方案处理的样品。PCR用于检测BRAF-E。BRAF-E测定用FAM检 测基因突变，用CYC5检测正常基因。测定Ct值，PCR反应中目标的浓度的相对量度，如本领 域普通技术人员已知。CRC样品的Ct数据显示于图11，δ-Ct(dCt:对照和测试样品之间 的Ct值的变化）显示于图12。小于13的dCt值被认为对于测试的肿瘤标志物是阳性的。 如从数据可见，本发明的胺提取程序与本领域Qiagen和Promega方法是至少一样好的（如 果不是更好），同时要求较少的处理步骤和更快的处理时间。更详细地，在图11中，说明两 个信号的循环阈值（CT值）。循环阈值是指PCR反应中的循环数，其中信号显著高于背景。 测定中更大量的目标允许用较低量循环生成信号，所以较低量表明较高量的目标。该图显 示来自结肠直肠癌组织C9和C13的FFPE材料的两个独立块的结果。从所述块制备连续切 片，且用三种不同的方法提取数字代表的分离切片。FAM信号是蓝色柱，且CY5信号是红色 柱。来自Qiagen处理的切片的信号用淡蓝色和红色柱代表，且标记为Qia。来自Promega 处理的切片的信号用深蓝色和红色柱代表，且标记为CSC。这两种方法都在从FFPE组织分 离DNA中使用蛋白酶消化。来自Abbott胺溶剂系统的信号由亮蓝色和红色柱代表。如图 中可见，来自Abbott提取的信号与用其他两种方法获得的信号相当。图12显示图11中的 FAM和CY5信号之间的差异。该dCT值用于帮助确定提取的组织是否是癌性的。小于13的 差异表明样品中存在相对较高量的突变基因（较低CT值），且样品可以是癌性的。这三种 不同的方法通过分别针对Qiagen、Promega和Abbott方法的浅绿色、深绿色和亮绿色柱说 明。在C9和C13样品两者中，Abbott方法给出与其他两种方法相当的dCT值。
[0126] 在图13和图14中，显示肺肿瘤FFPE组织的循环阈值（CT值）和dCT值。该图 显示来自肺肿瘤组织L1和L4的FFPE材料的两个独立块的结果。再次，从所述块制备连 续切片，且通过数字代表的分开切片用三种不同的方法提取。FAM信号是蓝色柱，且CY5信 号是红色柱。来自Qiagen处理的切片的信号用淡蓝色和红色柱代表，且标记为Qia。来自 Promega处理的切片的信号用深蓝色和红色柱代表，且标记为CSC。这两种方法都在从FFPE 组织分离DNA中使用蛋白酶消化。来自Abbott胺溶剂系统的信号由亮蓝色和红色柱代表。 如图中可见，来自Abbott提取的信号与用Promega系统和用Qiagen方法处理的样品之一 (L1)获得的信号相当。然而，L4样品处理的Qiagen方法不像Promega或Abbott方法那样 好地分离DNA。图14显示图13中的FAM和CY5信号之间的差异。这三种不同的方法通过 分别针对Qiagen、Promega和Abbott方法的浅绿色、深绿色和亮绿色柱说明。在两种L1样 品中，Abbott方法给出与其他两种方法相当的dCT值，而Qiagen方法似乎没有一样好地提 取L4样品。
[0127] 对黑色素瘤样品一式两份进行提取方案实验。提取和处理条件如上。图15显示 Ct数据，且图16显示dCt数据。在图15中，说明两个信号的循环阈值（CT值）。循环阈 值是指PCR反应中的循环数，其中信号显著高于背景。测定中更大量的目标允许用较低量 循环生成信号，所以较低量表明较高量的目标。该图显示来自黑色素瘤组织Mil和M14的 FFPE材料的两个独立块的结果。从所述块制备连续切片，且通过数字代表的分开切片用三 种不同的方法提取。FAM信号是蓝色柱，且CY5信号是红色柱。来自Qiagen处理的切片的 信号用淡蓝色和红色柱代表，且标记为Qia。来自Promega处理的切片的信号用深蓝色和红 色柱代表，且标记为CSC。这两种方法都在从FFPE组织分离DNA中使用蛋白酶消化。来自 Abbott胺溶剂系统的信号由亮蓝色和红色柱代表。如图中可见，来自Abbott提取的信号 与用其他两种方法获得的信号相当。图16显示图15中的FAM和CY5信号之间的差异。该 dCT值用于帮助确定提取的组织是否是癌性的。小于13的差异表明样品中存在相对较高量 的突变基因（较低CT值），且样品可以是癌性的。这三种不同的方法通过分别针对Qiagen、 Promega和Abbott方法的浅绿色、深绿色和亮绿色柱说明。在Mil样品中，Abbott方法似 乎给出比其他两种方法更好的dCT值（较低dCT)。M14样品显示有趣的模式，其中该组织 的一些切片具有高dCT值，但随着切片进一步进入样品，它们降低。这表明，组织块的一些 切片可不含肿瘤细胞，且必须测试多个切片。下面讨论从多个切片分离DNA的能力。
[0128] 这三个实验显示，本发明的胺溶剂提取过程与Qiagen和Promega方案表现至少一 样好，同时要求较少的处理步骤和更快的处理时间。
[0129] 实施例8 本发明的组合物和方法的多功能性提供相对于现有技术程序的改善。例如，对于载片 封固的样本，现有技术程序要求从载玻片刮擦样品。该步骤经受操作者误差。所需刮擦是 耗时的，使用锋利器具，且具有交叉污染的高可能性。本发明的组合物和方法允许直接从载 片提取DNA，而不从载片刮擦样品。此外，多个载片可以一起处理，以减轻切片变化引起的 可能测定变化（即，样品切片之间的变化引起的"有或无（hitormiss)"），或者帮助检测 低水平目标。可以在设计用于盛装多个载片的接受容器（RV)中处理载片。样品中的DNA 对于MMP比对于载玻片具有更大的亲和力（这可以是不同类型的玻璃和/或添加至过量 的MMP的结果）。图17显示具有本发明针对乙型肝炎病毒对照的组合物和方法处理的结 果的图，图18显示在裂解-孵育程序过程中添加MMP的相同程序。在方案中的该点添加 MMP导致DNA捕获在MMP上。在乳腺FFPE载片上进行的实验证明了该程序的有效性。用 LB-Et0H-3AlP或LB-3A1P提取样品，其中在孵育之后添加EtOH。还在有或没有MMP的情 况下孵育样品。对于每种条件，所述孵育在90°C持续2小时20分钟。图19显示，在有或 没有EtOH的情况下在裂解孵育中添加MMP导致DNA结合至MMP，如由dRn值所示。dRn代 表均一化响应的差值，这是其已经使用程序基线化之后来自PCR反应的荧光信号的值，所 述程序被称为Multianalyze4(AbbottMolecularin-housesoftwareprogram,Abbott Park,II。其他合适的方案是市售的，如本领域普通技术人员已知，这通过网址诸如www. gene-quantification,de/hkg.html和类似网址的教导所教导）。从dRn通过dRn的特定 阈值的点生成CT值。
[0130] 实施例9 在本实施例中，同时处理多个载片。在相同反应容器中处理1至4个载玻片。在处理 少于4个切片的条件下，空白载片用作占位物（placeholders)。一次处理多于一个载片 可以帮助检测低拷贝数目标。图20显示同时处理1至4个载片的结果。用每次处理额外 载片改进检测。测试乳腺组织FFPE和PathVysion-AProbeChekNormal载片（Abbott Laboratories,AbbottPark,II)。图 21 显不数据的单因素AN0VA分析。
[0131] 更详细地，图20是当在相同的反应容器中提取1至4个含有FFPE材料的载片时 生成的扩增曲线的图示。使用两个不同的载片集合。一个集合由仍含有石蜡的乳腺组织 FFPE载片组成。另一个集合含有PathVyson-AProbeChekNormal载片（FFPE处理的细 胞），其已经使用FISH方法检测，且在FISH处理过程中已经去除石蜡。图21具有两个图。 第一个显示两个提取集合的CY5CT值。Bl、B2、B3和Μ分别含有1、2、3、4个乳腺组织载 片。CT随着每个额外载片降低，这表明，在具有更大数目载片的扩增反应中存在更多DNA。 所述水平在3个载片后没有降低，且可以表明在该点提取最大水平的材料。MR值代表最大 比率（MaxRatio)，且表明扩增反应的幅度。较高MR值表明扩增反应更强健。MR值确实随 着具有4个载片的乳腺组织样品降低，这可以表明，用该组织的3个载片提取最大水平的材 料，且增加水平的石蜡可能是一个问题。来自FISH处理的载片（PV1至PV4)的材料还显示 CT值的降低，反应中具有更大数目的载片，和因此更多的DNA。CT值随着第四个载片继续下 降。MR值不随着添加的载片而减小。这载片集合没有石蜡，并且这可以反映在该数据中。
[0132] 实施例10 在本实施例中，先前处理用于荧光原位杂交（FISH)分析的载片用本发明的组合物和 方法进行处理。结果显示，核酸从先前处理用于FISH分析的载片提取，且分离的DNA适用 于从FISH过程载片提取之后的进一步分析。
[0133] 实施例11 从结核分枝杆菌（MTB)提取核酸。用3A1P裂解组合物裂解将溶解痰液，且从MTB提取 核酸。此外，该组合物可以用于灭活目标MTB。尽管不希望本发明受到理论限制，据信，本发 明的3A1P裂解组合物的高pH可以负责目标MTB的灭活。
【主权项】
1. 从细胞来源材料提取核酸的方法，所述方法包括： a) 提供i)细胞来源材料和ii)包含一种或多种胺单体的提取水溶液； b) 使所述细胞来源材料与所述提取溶液接触，导致细胞材料的裂解和核酸的提取。2. 权利要求1的方法，其中所述胺单体是伯胺单体。 3?权利要求2的方法，其中所述胺单体是2, 2' -(亚乙基二氧基）二（乙胺）（EDBE)。4. 权利要求2的方法，其中所述胺单体是1，3-二氨基丙烷。5. 权利要求2的方法，其中所述胺单体是3-氨基-1-丙醇。6. 权利要求1的方法，其中所述含水提取溶液进一步包含离液剂。7. 权利要求6的方法，其中所述离液剂选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇中的一种 或多种。8. 权利要求1的方法，其中所述含水提取溶液进一步包含去污剂和醇中的一种或多 种。9. 权利要求8的方法，其中所述去污剂选自Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱氧胆 酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton? X-IOO中的一种或多种。10. 权利要求9的方法，其中所述去污剂的浓度为约8%至约15%。11. 权利要求8的方法，其中所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。12. 权利要求11的方法，其中所述醇的浓度为约15%至约25%。13. 权利要求2的方法，其中所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约30 %至约50 %。14. 权利要求6的方法，其中所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4M至约5M。15. 权利要求1的方法，其中所述细胞来源材料选自活细胞来源材料和固定细胞来源 材料。16. 权利要求15的方法，其中所述活细胞来源材料包含单细胞的悬浮液。17. 权利要求16的方法，其中所述细胞的悬浮液包含细菌。18. 权利要求17的方法，其中所述细菌是分枝杆菌。19. 权利要求15的方法，其中所述细胞的悬浮液包含酵母。20. 权利要求1的方法，其中所述含水提取溶液是无酶的。21. 权利要求1的方法，其中所述含水提取溶液是无蛋白酶的。22. 权利要求15,其中所述固定细胞来源材料包含福尔马林固定石蜡包埋（FFPE)材 料。23. 包含适于从细胞来源材料提取核酸的含水提取溶液的组合物，所述组合物包含一 种或多种胺单体；一种或多种离液试剂，一种或多种去污剂和一种或多种有机溶剂。24. 权利要求23的组合物，其中所述胺单体是伯胺单体。 25?权利要求24的组合物，其中所述胺单体是2, 2' -(亚乙基二氧基）二（乙胺） (EDBE)〇26. 权利要求24的组合物，其中所述胺单体是1，3-二氨基丙烷。27. 权利要求24的组合物，其中所述胺单体是3-氨基-1-丙醇。28. 权利要求24的组合物，其中所述离液剂选自脲、硫氰酸胍（GITC)、乙醇和丁醇中的 一种或多种。29. 权利要求24的组合物，其中所述去污剂选自Tween?、聚山梨醇酯、脱氧胆酸盐、脱 氧胆酸钠和十二烷基硫酸钠（SDS)、NP-40和Triton? X-IOO中的一种或多种。30. 权利要求29的组合物，其中所述去污剂的浓度为约8%至约15%。31. 权利要求24的组合物，其中所述醇选自乙醇和丁醇中的一种或多种。32. 权利要求31的组合物，其中所述醇的浓度为约15%至约25%。33. 权利要求24的组合物，其中所述含水提取溶液中的胺单体的浓度为约30 %至约 50 %〇34. 权利要求28的组合物，其中所述含水提取溶液中的离液剂的浓度为约4M至约5M。
【专利摘要】用于从新鲜、固定或固定且包埋的细胞、组织、生物材料和细胞来源材料有效提取、富集和分离核酸的组合物和方法。用于从细胞来源材料和特别是石蜡包埋的组织样品（例如福尔马林固定的石蜡包埋的样品：FFPE）提取核酸的现有技术方法涉及复杂的、多步骤的过程。
【IPC分类】C12P19/34
【公开号】CN105247065
【申请号】CN201480015429
【发明人】G.J.冈林
【申请人】雅培分子公司
【公开日】2016年1月13日
【申请日】2014年3月14日
【公告号】CA2901369A1, EP2971032A1, US20140275510, US20140288293, WO2014144174A1